Скрининг бактериурии с определением морфологии бактерий методом автоматизированной проточной цитофлуориметрии на анализаторе Sysmex UF-1000i
Л. И. Станкевич, к.м.н., медицинский директор, П. Ч. Г. Гонтард, директор, Е. С. Герасимова, директор производства, В. В. Загорельский, руководитель отделения Бактериология
Группа компаний СИТИЛАБ, Научно-методический центр клинической лабораторной диагностики СИТИЛАБ, г. Москва
Вступление
В современной медицине диагностика имеет особое значение и проводить ее необходимо быстро. В структуре общей инфекционной заболеваемости инфекции мочевых путей (ИМП) занимают второе место, уступая лишь респираторным инфекциям. Распространенность ИМП в России составляет около 1000 случаев на 100000 населения в год [1]. Среди внутрибольничных инфекций доля ИМП может достигать 40% [2]. Для своевременного выявления таких осложнений крайне важна роль лаборатории как информационного источника в диагностическом процессе.
Референсным методом скрининга бактериурии служит микробиологическое исследование мочи при посеве – трудоемкое и длительное [3]. Внедрение в лабораторную практику методологии выявления бактериурии до посева (предпосевной скрининг мочи) с помощью метода проточной цитофлуориметрии на анализаторе Sysmex UF-1000i позволяет установить хорошо налаженный рабочий процесс выявления образцов с признаками ИМП и немедленного информирования клинициста об образцах с негативными результатами. Как уже было исследовано ранее, образцы с признаками ИМП, выявленные при общем анализе мочи, могут быть сразу направлены на бактериологическое исследование. Таким образом, сокращается время анализа, по крайней мере, на один день. Такие возможности ускорения процесса диагностики крайне важны, прежде всего, для пациента, который получает правильное лечение гораздо раньше [4].
Анализатор мочи с технологией проточной цитофлуориметрии Sysmex UF-1000i предоставляет пользователю широкий диапазон клинических преимуществ. Например, количественное определение лейкоцитов, бактерий и дрожжевых клеток для очень быстрого исключения инфекций мочевых путей или воспалений, подсчет эритроцитов и оценку их морфологии для того, чтобы быстро определить потенциальный источник гематурии, а также проводимость мочи как маркер статуса диуреза пациента [5].
В 2015 году на российском рынке разработчиками компании Sysmex представлено новое программное обеспечение для автоматической идентификации морфологии бактерий. Данная программа выдает заключение в виде флагов Rods (палочки) или Cocci/Mixed (кокки/смешанная флора), опираясь на вид скаттерограммы [6]. Таким образом, в позитивных относительно бактериурии образцах мочи предоставляется информация о морфологии бактерий еще до того, как они будут направлены на посев, идентификацию и тестирование на чувствительность к антимикробным препаратам. Это может быть крайне важно в случаях необходимости быстро и точно подобрать антибактериальную терапию не дожидаясь результата бактериологического исследования.
Цель работы
Исследовать диагностические возможности автоматизированного проточного цитометра UF-1000i (Sysmex) в качестве инструмента для скрининга проб мочи в бактериологии и ввести протокол предпосевной оценки бактериурии и определения морфологии бактерий.
Материалы и методы
Всего в исследование включили 1149 образцов мочи: 165 – дети до 16 лет, 837 – взрослые женщины, 147 – взрослые мужчины.
Мочу собирали в одноразовые стерильные вакуумные пробирки BD Vacutainer® (Becton Dickinson, США) для микробиологического анализа мочи, которые содержат консервант (борная кислота, формиат натрия, борат натрия) и обеспечивают стабильность образцов мочи 48 часов при комнатной температуре.
В настоящей работе проводилось параллельное тестирование проб мочи, поступивших на посев в бактериологическую лабораторию “Ситилаб”, г. Москва двумя методами:
1) на анализаторе UF-1000i (Sysmex Corporation, Япония) для точного подсчета количества бактерийи определения морфологии бактерий в моче.
2) методом бактериологического посева на автоматической системе рассева клинических образцов PREVI Isola (bioMerieux, Франция), с последующей идентификацией микроорганизмов методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF) на анализаторе VITEK MS (bioMerieux, Франция). Посев производился на двухсекционные чашки, содержащие 5% кровяной агар (основа колумбийского агара (Pronadisa, Испания) + 5% крови КРС) и хромогенную среду для выявления основных мочевых патогенов “Уриселект” (BioRad, США).
Таблица 1. Сводные результаты параллельного тестирования образцов мочи на анализаторе UF 1000i (Sysmex) и бактериологического посева мочи на плотные питательные среды
|
Sysmex UF 1000i |
Рост бактериальной культуры при посеве |
||
|
Количество |
Количество |
Количество отрицательных результатов (нет |
Количество положительных результатов (обнаружен рост бактерий в моче; |
|
<103/мл |
2 |
2 |
0 |
|
103/мл |
103 |
89 |
14 |
|
104/мл |
466 |
336 |
130 |
|
105/мл |
298 |
162 |
136 |
|
106/мл |
156 |
40 |
116 |
|
107/мл |
124 |
3 |
121 |
|
Всего: |
1149 |
632 |
517 |
Результаты
Из 1149 образцов, 632 пробы (55%) были отрицательными при посеве на плотные питательные среды. Положительный результат микробиологического исследования, то есть бактериальный рост (cut-off ≥104 КОЕ/мл для традиционного посева) был обнаружен в 517 пробах (45%).
Сводная таблица результатов параллельного тестирования образцов мочи на анализаторе UF 1000i (Sysmex) и бактериологического посева мочи на плотные питательные среды представлена в таблице 1.
При использовании для анализатора Sysmex UF-1000i cut-off 104 бактерий/мл было получено 503 положительных результата из всех 517 проб, положительных в посевах, что составляет 97,3%. 14 положительных посевов было в образцах с концентрацией бактерий 103/мл. В образцах с результатами счета бактерий в пределах 104/мл по данным анализатора Sysmex UF-1000i, дали рост в посевах только 27,9% образцов (130 из 466). В образцах с результатами счета бактерий в пределах 105/мл по данным анализатора Sysmex UF-1000i, дали рост в посевах 45,6% образцов (136 из 298). В образцах с концентрациями бактерий 106/мл и 107/мл, дали рост на чашках 74,4% и 97,6%, соответственно. Согласно этим данным, уровень бактериурии на анализаторе Sysmex UF-1000i (уровень cut-off), который оптимально разделяет образцы с положительными и отрицательными результатами традиционного посева находится в интервале 104/мл – 105/мл. Полученные данные согласуются с ранее опубликованными результатами параллельного тестирования относительно выявления бактериурии методом проточной цитофлуориметрии и технологией лазерного светорассеяния на анализаторе HB&L (Alifax, Италия) [4], при котором был валидирован уровень cut-off – 105 бакт/мл. В исследовании педиатрических образцов оптимальное пороговое значение cut-off было определено как 1,2 х 104 бактерий/мл [7].
Очевидно, что уровень cut-off (бактерий/мл) для метода проточной цитофлуориметрии при предпосевном скрининге мочи зависит как от метода сравнения, так и от характера проб (педиатрические, акушерские, амбулаторные и т. п.).
Значительное количество проб, которые не дают роста бактерий на питательных средах, но при этом имеют счет бактерий выше cut-off на анализаторе SysmexUF-1000i, может объясняться рядом причин. В предыдущих работах было показано, что 15% образцов мочи, поступающих на бактериологическое исследование, имеют остаточную антимикробную активность образца. То есть в них обнаруживаются следы антимикробных препаратов, что может препятствовать росту культуры при посевах [4]. В таких случаях отрицательный результат посева признавался “ложноотрицательным”. В отличие от традиционного посева, при котором выявляется рост живых микроорганизмов, анализатор SysmexUF-1000i выявляет бактерии вне зависимости от их жизнеспособности. Это дает анализатору SysmexUF-1000i определенные преимущества перед микробиологическим исследованием при выявлении бактерий в пробах, полученных после начала антибактериальной терапии. Помимо этого, счет бактерий высокоточным методом проточной цитофлуориметрии чувствителен к нарушению правил преаналитики. Например, у женщин при попадании в образец мочи влагалищного содержимого, счет бактерий на анализаторе SysmexUF-1000i будет завышен, а роста культуры на питательных средах получено не будет.
Другой задачей нашей работы было исследование диагностических возможностей нового программного обеспечения Sysmex UF-1000i – автоматической идентификации морфологии бактерий. Для этого, по рекомендации производителя (как наиболее достоверные результаты), были отобраны результаты положительных посевов с заключением о морфологии бактерий в виде флагов Rods (палочки). Результаты с флагами Cocci/Mixed (кокки/смешанная флора) были исключены по причине возможной контаминации и наличия нескольких типов бактерий.
Таким образом, в исследование включили 166 образцов с заключением о морфологии бактерий в виде флагов Rods (палочки). Среди них 9 проб – дети до 16 лет, 136 – взрослые женщины, 21 – взрослые мужчины.
После проведения идентификации микроорганизмов на анализаторе VITEK MS (bioMerieux, Франция) в этих же образцах мочи было выявлено 77% совпадений морфологии бактерий (палочки), 17% результатов не совпало, в 6% случаев кроме палочек присутствовали кокки (смешанная флора). Данные результаты представлены на Диаграмме 1.
Выводы
1) Настоящая работа показала, что значение бактериурии 104-105 бактерий/мл с анализатора Sysmex UF-1000i может быть валидировано как cut-off для отбора образцов на посев при сравнении с классическим методом посева на плотные питательные среды.
2) Новое программное обеспечение Sysmex UF-1000i автоматической идентификации морфологии бактерий дает высокий процент сходимости результатов (77%) относительно флагов Rods (палочки) с идентификацией методом масс-спектрометрии. Данная информацияможет быть важной для выбора правильной тактики ведения пациента, так как позволяет клиницисту уже на этапе скрининга правильно подбирать антибактериальную терапию до получения результатов посева.
3) Метод проточной цитофлуориметрии позволяет сделать скрининг мочи относительно бактериурии быстрым (минуты) и точным, подбирать антибактериальную терапию не эмпирически, а на основе морфологии бактерий, а также удешевить процесс исследования на бактериурию.
Литература
1) Лоран О. Б. Эпидемиологические аспекты инфекций мочевыводящих путей. // Материалы международного симпозиума “Инфекции мочевыводящих путей у амбулаторных больных”. Москва. 1999. С. 5-8.
2) Stamm W.E. Scientific and clinical challenges in the management of urinary tract infections. // Am J Med. – № 113. – C. 1-4.
3) Shaikh N., Morone N.E., Lopez J. et al. Does this child have a urinary tract infection? // JAMA. – 2007. – № 298. – C. 2895-2904.
4) Станкевич Л. И., Герасимова Е. С., Загорельский В. В. “Скрининг бактериурии с помощью, автоматизированной проточной цитометрии на анализаторе UF1000i Sysmex как инструмент для отбора образцов мочи на посев”// “Поликлиника” // Лаборатория ЛПУ. – 2014. – 4 (1). – С.13-16.
5) Manoni F., Gessoni G., Alessio M.G. et al. Gender,s equality in evaluation of urine particles: Results of a multicenter study of the Italian Urinalysis Group. // Clinical ChimicaActa. – 2014. – Vol. 427. – C. 1-5.
6) UF-1000i/UF-500i Upgrading Software Bacteria morphology // Руководство по эксплуатации. – 2013 (09).
7) Маянский Н. А., Мотузова О. В., Калакуцкая А. Н., Семикина Е. Л., Катосова Л. К. Скрининг бактериурии у детей с помощью автоматизированной проточной цитометрии на анализаторе SysmexUF-1000i// Вопросы диагностики в педиатрии. – 2011. – Том 3, № 3. – С.12-16.