В настоящее время антикоагулянтная терапия является одним из самых востребованных подходов в современной практической медицине. Применение антикоагулянтов часто требует тщательного лабораторного мониторинга, который невозможен без обеспечения должного уровня внутрилабораторного контроля качества исследований.

Выделяют две основные группы антикоагулянтных препаратов: прямого и непрямого действия. Первые действуют путем непосредственного ингибирования тромбина и других факторов свертывания. К ним относят нефракционированный гепарин (НФГ), низкомолекулярные гепарины (НМГ) и так называемые “новые” антикоагулянты – препараты избирательного действия, блокирующие тромбин, фактор Xа и др. По нашему мнению, которое сходится с мнением многих авторов, лабораторный контроль за применением вышеуказанных лекарственных препаратов в большинстве случаев обязателен и необходим.

Вторая группа антикоагулянтов – это вещества непрямого длительного действия: синтетические производные кумарина и индандиона, которые нарушают образование в печени активной формы витамина К. В отличие от лекарственных средств, тормозящих формирование фибрина, оральные антикоагулянты препятствуют образованию в гепатоцитах полноценных в коагуляционном отношении факторов II, VII, IX и X, вызывая состояние гипокоагуляции. Противотромботическое действие считается полноценным, когда снижается концентрация и активность факторов свертывания. Трудности при лечении непрямыми оральными антикоагулянтами заключаются в необходимости выбора такой оптимальной дозы препарата, которая обеспечивала бы предотвращение тромбообразования, не вызывая при этом кровотечения.

У терапии непрямыми антикоагулянтами тоже есть обязательное условие – необходимость постоянного контроля, лабораторного мониторинга. По рекомендации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для контроля терапии непрямыми оральными антикоагулянтами необходимо определять Международное Нормализованное Отношение (МНО) [13]. Необходимость контроля МНО у пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты, подтверждается клиническими исследованиями: доказано, что риски возникновения кровотечений, инсультов и смертельных исходов напрямую зависят от качества и частоты контроля уровня МНО [2, 11].

Метод определения МНО был принят ВОЗ в 1983 г. [12] и введен в клиническую практику с целью стандартизации результатов определения протромбинового времени (ПВ). МНО рассчитывается по формуле:

МНО = (ПВп/ПВ100%)МИЧ, где

ПВп – ПВ плазмы пациента (сек),

ПВ100% – среднее нормальное ПВ (сек),

МИЧ – Международный Индекс Чувствительности.

МИЧ представляет собой количественную оценку чувствительности тромбопластина к изменениям активности факторов, вызванным приемом оральных антикоагулянтов. Производители должны определять чувствительность каждой серии выпускаемых тромбопластинов по утвержденной методике, сравнивая ее с международным стандартом тромбопластина [13]. Кроме того, выпускаемые тромбопластины должны удовлетворять ряду требований по стабильности, отсутствию примесей и т.п.

В целом, широкое внедрение определения МНО в мире в последние годы привело к значительному улучшению качества контроля антикоагулянтной терапии [5]. Тем не менее, для получения адекватных результатов требуется точность и правильность определения сразу нескольких величин, входящих в формулу расчета МНО – ПВ, ПВ100% и МИЧ.

Среди параметров, влияющих на точность определения МНО, Институт Клинических и Лабораторных Стандартов (CLSI) [4] выделяет, во-первых, погрешность определения МИЧ тромбопластина производителем. Ввиду ограниченного количества первичного международного стандарта невозможна калибровка каждой партии производимых в мире реагентов, поэтому широко используются вторичные и внутренние стандарты. В результате накопления систематических ошибок каждой стадии калибровки у некоторых производителей конечное значение МИЧ тромбопластина уже может нести в себе погрешность 10% и более. Как результат, еще больше варьирует точность определяемого значения МНО. Допустимо использование тромбопластинов с МИЧ от 0,9 до 1,7 [13]. Однако чем выше значение МИЧ, тем менее чувствителен тромбопластин к изменению содержания компонентов протромбинового комплекса и тем больше может быть ошибка результата.

В формулу для вычисления МНО также входит среднее протромбиновое время нормальной плазмы (ПВ100%). Использование неточного значения ПВ100% может оказывать влияние на значение МНО, приводя к его систематическому завышению или занижению. Согласно рекомендациям ВОЗ среднее нормальное протромбиновое время представляет собой среднее геометрическое значение ПВ плазм популяции здоровых доноров, на практике определяется как среднее геометрическое значений протромбинового времени плазмы от не менее 20 взрослых здоровых доноров обоих полов и должно рассчитываться в каждой лаборатории самостоятельно по формуле,

ПВ100% = корень n степени ПВ1 * ПВ2 * ПВ3 *... * ПВn

где n ≥ 20.

Многие лаборатории находят ПВ100% как среднее арифметическое, однако такой расчет нежелателен: было показано, что применение среднего геометрического значения дает более точные результаты [7]. Ввиду трудоемкости определения среднего нормального протромбинового времени, допускаются упрощенные способы нахождения этого параметра путем использования специальных аттестованных пулированных лиофилизированных плазм [4]. Однако следует помнить, что само по себе значение ПВ нормальной лиофилизированной плазмы в общем случае не равно ПВ100% и требует дополнительной корректировки согласно рекомендациям производителя.

Наконец, важно точно измерить ПВ плазмы пациента, не допустив ошибок на преаналитическом и аналитическом (лабораторном) этапах исследования. В целом, строгая стандартизация внутрилабораторной составляющей преаналитического этапа является необходимым требованием контроля качества всех коагулологических исследований и играет крайне важную роль при определении ПВ/МНО. На этом этапе необходимо строго следовать требованиям к лабораторной посуде, оборудованию, проводить мониторинг рабочего состояния холодильников, таймеров, качества дистиллированной воды, стабильности и условий хранения реагентов, а также к взятию биоматериалов, их обработке, транспортировке и хранению.

В работе [1] проводилось детальное изучение влияния факторов преаналитического этапа на правильность определения ПВ/МНО в плазме больных, находящихся на терапии непрямыми оральными антикоагулянтами. Было показано, что значительное неблагоприятное влияние на результаты ПВ/МНО оказывают увеличение продолжительности преаналитического этапа и горизонтальное положение пробирок при транспортировке.

На результаты определения ПВ влияет также концентрация используемого при взятии крови антикоагулянта. В настоящее время по рекомендациям CLSI при выполнении коагулологических исследований предпочтительным является применение 3,2% (0,109 М) цитрата натрия [10]. Эта концентрация цитрата натрия вызывает меньшую частоту ошибок, связанных с преаналитическим этапом исследований. Исследования показали, что использование 3,8% (0,129 М) раствора цитрата натрия приводит к удлинению протромбинового времени [3]. Во избежание существенных ошибок для определения ПВ при взятии крови следует использовать 0,109 М раствор трехзамещенного цитрата натрия в соотношении кровь/антикоагулянт = 9:1 [13]. Также рекомендуют использовать при определении ПВ раствор трехзамещенного цитрата натрия в концентрации от 0,105 М до 0,109 М, раствор цитрата натрия с концентрацией 0,129 М (3,8%) не должен быть использован [9].

Следует помнить, что ошибки, допущенные на преаналитическом этапе исследования, нельзя скорректировать проведением процедур верификации и внутрилабораторного контроля качества коагулологических тестов.

Изначально система стандартизации теста ПВ была основана на ручном методе определения и предполагала присвоение одного значения МИЧ каждой партии тромбопластина. Однако в последние годы на смену ручному методу пришло использование разнообразных автоматических и полуавтоматических коагулометров, и исследования показали, что значения МИЧ могут зависеть от типа используемого прибора [8]. Поэтому ВОЗ и Международное общество по изучению тромбозов и гемостаза (ISTH) рекомендуют лабораториям осуществлять обязательный внутрилабораторный контроль правильности определения МНО на конкретной измерительной системе “прибор-реагент” вне зависимости от производителя того и другого, а также проводить собственную калибровку с использованием аттестованных плазм.

Описано два способа проведения такой калибровки. Первый из них – определение МИЧ тромбопластина по методике, аналогичной предложенной ВОЗ, либо по подобной методике, но с использованием аттестованных лиофилизированных плазм. Оба метода являются весьма трудоемкими, требуют проведения калибровки по большому числу плазм, и на практике их применение представляется сложно осуществимым, особенно в небольших лабораториях.

Альтернативный метод – “прямое” определение МНО по калибровочному графику [6]. Этот подход заключается в построении калибровочного графика в билогарифмических координатах для МНО, указанного производителем контрольной плазмы и определенного этим производителем ручным методом, и соответствующего значения ПВ, определенного на исследуемой измерительной системе “прибор-реагент”. Значения МНО плазмы пациентов могут быть интерполированы по полученной линии ортогональной регрессии зависимости

ln(ПВ)-ln(МНО) и не требуют учета МИЧ и ПВ100%. Необходимо построение прямой с использованием не менее 3 пулированных патологических и 1 пулированной нормальной плазмы, где каждый пул получен из не менее 10 плазм доноров или пациентов, находящихся на длительной терапии непрямыми оральными антикоагулянтами. В качестве патологических плазм допустимо также использование пулированных плазм здоровых доноров с искусственно сниженным уровнем параметров гемостаза.

С целью упрощения процедуры контроля CLSI предлагает проводить калибровку системы после получения неудовлетворительных результатов процедуры верификации определения МНО [4]. Для проведения такого контроля необходим набор аттестованных плазм, состоящий как минимум из трех плазм со значением МНО, покрывающим весь исследуемый диапазон (1,5-4,5). Протокол процедуры верификации заключается в определении МНО для каждой плазмы с использованием исследуемой системы “прибор-реагент”. Все измерения рекомендуется повторять не менее двух раз на протяжении двух дней, чтобы убедиться, что разница между каждым пов-

торением в течение одного дня и разница между средними значениями для каждого из двух дней не превышает 10%. Такой контроль доступен для всех лабораторий и может быть проведен с использованием реагентов российского производства.

Процедура проверки проводится для всех приборов, используемых в лаборатории, даже если они относятся к одной и той же модели одного производителя. Контроль необходим каждый раз при смене реагента, партии реагента, прибора или после его ремонта. В случае постоянства всего указанного, контроль проводят не менее одного раза в год. Если вычисленные значения МНО не укладываются в диапазон “МНО, указанное производителем, ± 15%”, результаты измерений МНО пациентов не могут считаться достоверными. В этом случае необходимо убедиться в правильнос-

ти функционирования прибора и отсутствии ошибок в самой процедуре верификации или обратиться к производителю.

Следует отметить, что процедуру внутрилабораторного контроля правильности определения МНО с помощью набора аттестованных плазм рекомендуют проводить после обязательной рутинной проверки контроля качества исследований с использованием обычных контрольных плазм.

Очевидно, что качество коагулологических исследований напрямую зависит от качества используемых реагентов и контрольных материалов. НПО “Ренам” МБООИ “Общество больных гемофилией”, являющийся общепризнанным российским производителем полного цикла реагентов, калибраторов и контрольных материалов для исследования системы гемостаза, разрабатывает и производит весь спектр необходимых реагентов для контроля терапии как прямыми, так и непрямыми антикоагулянтами в соответствии с современными рекомендациями ВОЗ. Качество производимой продукции подтверждается международным контролем и соответствием требованиям ИСО и директивы 98/79/ЕС.

В заключение еще раз подчеркнем, что качество мониторинга за лечением антикоагулянтными препаратами напрямую зависит от высокого уровня внутрилабораторного контроля качества соответствующих коагулологических исследований, складывающегося, в свою очередь, из строгого соблюдения всех требований стандартизации как на преаналитическом, так и на аналитическом этапах исследования.

Список использованной литературы

1. Брутцова Н.А. Влияние различных факторов преаналитического и аналитического периодов на ПВ/МНО при мониторинге оральной антикоагулянтной терапии // Тромбоз, гемостаз и реология. 2008. № 2. С. 16-21.

2. Журавлева И.Ю., Горбунова Е.В., Рутковская Н.В., Буркова Т.В., Одаренко Ю.Н., Кокорин С.Г., Савостьянова Ю.Ю. Качество антикоагулянтной терапии варфарином у больных с протезами клапанов сердца // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. 2012. № 3. С. 60-65.

3. Adcock D.M., Kressin D.C., Marlar R.A. Effect of 3.2% vs 3.8% sodium citrate concentration on routine coagulation testing // Am. J. Clin. Pathol. 1997. V. 107. P. 105-110.

4. Adcock D.M., Brien W.F., Duff S.L., Johnston M., Kitchen S., Marlar R.A., Ng V.L., van den Besselaar T., Woodhams B.J. Procedures for Validation of INR and Local Calibration of PT/INR Systems: Approved Guideline; CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Document H54-A, Vol. 25, No. 23, Replaces H54-P, Vol. 24, No. 30 (formerly NCCLS). 2005.

5. Poller L. International Normalized Ratios (INR): the first 20 years // Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2004. № 2. P. 849-860.

6. Poller L., Ibrahim S., Keown M., Pattison A., Jespersen J. Simplified Method for International Normalized Ratio (INR) Derivation Based on the Prothrombin Time/INR Line: An International Study // Clinical Chemistry. 2010. V. 56 (10). P. 1608-1617.

7. Van den Besselaar A.M.H.P. Precision and accuracy of the International Normalized Ratio in oral anticoagulant control // Haemostasis. V. 26 (Suppl. 4). 1996. P. 248-265.

8. Van den Besselaar A.M.H.P., Houbouyan L.L., Aillaud M.F., Denson K.W.E., Johnston M., Kitchen S., Lindahl T.L., Marren M., Martinuzzo M.E., Droulle C., Tripodi A., Vergnes C. Influence of three types of automated coagulometers on the international sensitivity index (ISI) of rabbit, human, and recombinant human tissue factor preparations. A multicenter study // Thromb. Haemost. 1999. V. 81. P. 66–70.

9. Van den Besselaar A.M.H.P., Barrowcliffe T.W., Houbouyan-Réveillard L.L., Jespersen J., Johnston M., Poller L., Tripodi A.: On Behalf of the Subcommittee on Control of Anticoagulation of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH: Guidelines on Preparation, Certification, and use of Certified Plasmas for ISI Calibration and INR Determination // Journal of Thrombosis and Haemostasis. № 2. 2004. P. 1946-1953.

10. Wayne P.A.: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays: Approved Guideline. 5th ed. CLSI document H21-A5. 2008.

11. White H.D., Gruber M., Feyzi J., Kaatz S., Tse H.F., Husted S., Albers G.W. Comparison of outcomes among patients randomized to warfarin therapy according to anticoagulant control: results from SPORTIF III and V // Arch. Intern. Med. 2007. V. 167 (3). P. 239-245.

12. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Requirements for thromboplastins and plasma used to control oral anticoagulant therapy (Requirements for Biological Substances no. 30, revised 1982). Thirty-Third report. Annex 3, WHO Technical Report Series no. 687. Geneva: WHO, 1983.

13. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Guidelines for Thromboplastins and Plasma Used to Control Oral Anticoagulant Therapy. WHO Technical Report Series no. 889. Geneva: WHO, 1999. P. 64-93.