СКАЧАТЬ (13,4 Кб в архиве, формат - MS Word) |
|
ПРИ ПУБЛИКАЦИИ МАТЕРИАЛОВ ССЫЛКА НА ИСТОЧНИК ОБЯЗАТЕЛЬНА !!! |
|
ДИАГНОСТИКА ВОЛЧАНОЧНОГО АНТИКОАГУЛЯНТА. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ВНЕШНИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
А.Л. Берковский, Е.В.Сергеева, А.В.Суворов, И.С.Ульянова, Н.Д.Качалова, А.А.Козлов.
УДК 615.273.53; 612.08; 612.117.5.
Гематологический научный центр РАМН, Москва
Волчаночный антикоагулянт (ВА) является компонентном антифосфолипидных антител, обуславливающих как подавление свертывания крови, так и “антифосфолипидный синдром”, клиническое проявление которого в основном заключается в развитии артериальных и венозных тромбозов. ВА относится к антителам, специфичным для фосфолипидов, фосфолипид-связывающих белков и комплексов фосфолипидов с данными белками. Наличие ВА может вызывать и ингибирование развитие тромботических состояний, что связано с его воздействием на гетерогенные антигенные мишени в системе гемостаза. Так, ВА связывается с фосфолипидами только в присутствие таких кофакторных белков как протромбин, протеин С, аннексин, что непосредственно изменяет состояние системы гемостаза. Известна связь ВА с активацией сосудистого эндотелия и тромбоцитов, воспалительными процессами сосудистой стенки. Кроме антикоагулянтного действия ВА может увеличивать образование тромбина, клеточную экспрессию тканевого фактора и его активность (подавление ингибитора пути тканевого фактора), изменять активность фибринолитической системы, системы протеина С и антитромбинов. ВА часто обуславливает различные патологии беременности [3, 9, 10, 11,12, 15, 16, 17].
Наличие, так называемого “парадокса ВА” (пролонгирование в тестах свертывания крови несмотря на проявления клинической тромбофилии, неспособность в ряде случаев определять наличие ВА в плазме больных с повышенной активностью факторов внутреннего пути свертывания крови [1] свидетельствуют о необходимости адекватного проведения диагностики ВА.
Тесты для выявления ВА проводят, используя реагенты, содержащие низкую концентрацию фосфолипидов, для усиления различия между нормальной и патологической плазмами, и реагенты с высокой концентрацией фосфолипидов или тромбоцитарных мембран для истощения антикоагулянтного эффекта ВА. Подкомитет по Волчаночному Антикоагулянту Комитета по Науке и Стандартизации Международного Общества по Тромбозам и Гемостазу предложил определенные критерии для диагностики ВА. Они включают:
• удлинение одного или более фосфолипид-зависимых скрининговых коагуляционных тестов;
• отсутствие коррекции удлинения теста при смешивании исследуемого образца с нормальной плазмой;
• коррекция удлинения теста при избытке фосфолипидов и
• отсутствие специфических ингибиторов любых факторов свертывающей системы крови.
Строгое соблюдение этих критериев, а также проведения не менее трех скриннинговых и подтверждающих тестов обеспечивает надежную лабораторную диагностику ВА. Применение двух различных скрининговых тестов обеспечивает процент выявления ВА 80 – 85%. При добавлении к тестпанели третьего метода процент выявления повышается вплоть до 100%. Чувствительность фосфолипид-содержащих тестов к наличию ВА варьирует в широких пределах, так как до сих пор содержание и состав фосфолипидов в коммерчески доступных реагентах не стандартизовано. Так как наличие тромбоцитарных мембран влияет на результаты тестирования, необходимо диагностику ВА проводить в плазме, лишенной тромбоцитов [2, 7, 8, 11, 13].
Целью данной работы является оценка созданной панели реагентов для диагностики ВА в условиях Международного Внешнего Контроля Качества. Точность и правильность предлагаемой совокупности методов оценивалась по данным программы ECAT Foundation, Нидерланды.
Материалы и методы. В нашем исследовании были применены коагулологические методы, утвержденные Стандартами Предприятия ГНЦ РАМН [4,5] и панель реагентов (производство НПО РЕНАМ).
Для определения ВА использовали тесты АЧТВ, ПВ (протромбиновое время с разбавленным тромбопластином), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT или ВА). Методы подразделялись на скрининговые (с использованием реагентов с низким содержанием фосфолипидов: AЧТВс, ВАс и ПВс) и подтверждающие (с использованием реагентов с высоким содержанием фосфолипидов: АЧТВп, ВАп и ПВп). Для проведения тестов со смешением плазм использовали скрининговые реагенты. Для контроля качества проведения анализов использовали нормальную плазму и контрольные плазмы с различным уровнем ВА, производства НПО Ренам и Dade Behring (Германия). Нормальные значения (М±2 SD) составляли для АЧТВс – 30-40сек, АЧТВп – 25-35сек, ПВс – 45-60 сек, ПВп – 14-18 сек, ВАс – 22-29 сек, ВАп – 20-26 сек.
Диагностику ВА проводили по рекомендуемому Подкомитетом по Волчаночному Антикоагулянту алгоритму. Результаты скрининговых тестов (АЧТВс, ПВс, ВАс) выражали в виде скрининговых отношений СО=То/Тн, где То – время свертывания опытной плазмы, Тн – время свертывания нормальной плазмы (пулированная бестромбоцитарная донорская плазма или коммерческая нормальная донорская плазма). При СО < 1,2 ВА отсутствует, при СО> или = 1,2 проводили тесты со смешением плазм. Рассчитывали СО смеси плазм (сп) в виде СОсп=Тсп/Тн. Величина СОсп<1,2 свидетельствует об аномалиях факторов свертыва-ния крови, а СО>1,2 – о наличие в исследуемой плазме специфических ингибиторов факторов свертывания крови или неспецифических – ВА. Для решения вопроса о природе присутствующего в исследуемой плазме ингибитора, проводили подтверждающие тесты с добавлением к исследуемой плазме избытка компенсирующих фосфолипидов (АЧТВп, ПВп, ВАп). Результаты выражали в виде подтверждающего отношения ПО=То/Тн. Решение о наличие ВА принимали после расчета нормализованного отношения НО=СО/ПО для каждого теста. При значении НО>1,2 даже в одном тесте исследуемый образец плазмы считали положительным по ВА.
Результаты и обсуждение. Оценку результатов примененных методов выявления ВА на основе созданной панели реагентов осуществляли в течение трех лет (2005-2007 г.г) по программе Внешнего Контроля Качества. Исследовали 9 образцов Международной программы ECAT Foundation, Нидерланды. В определении ВА участвовало по программе ECAT 250-330 лабораторий (по отдельным пробам). Пробы представляли собой плазму больных с возможным или установленным наличием ВА. ЕСАТ статистически анализировала результаты определения АЧТВ, ПВ и dRVVT в скрининговых, подтверждающих тестах и тестах со смешением плазм по всем участвующим лабораториям для каждой исследуемой пробы. Конечные результаты анализа представлялись в виде допустимых значений (М±3SD) по величинам трех нормализованных отношений для используемых тестов, и по количеству лабораторий, делавших вывод или об отсутствии ВА или о наличии ВА различной степени выраженности. Данные анализа ЕСАТ позволяют оценить правильность выявления ВА каждым участником программы по всем тестам и в целом. Коэффициент межлабораторных вариаций нормализованных отношений по данным ЕСАТ составлял 14-39%.
Соотношение полученных нами результатов определения ВА в исследуемых образцах с таковыми всех участников программы ЕСАТ представлено в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Допустимые пределы и полученные нормализованные отношения (НО) по трем тестам.
№ образца |
Допустимые пределы |
Нормализованное отношение (НО) для теста: |
|||
АЧТВ |
ПВ |
ВА |
|||
Образцы со слабо (вероятно) положительным ВА* |
|||||
07.21 |
0,70-2,0 |
1,11 |
1,33 |
1,04 |
|
05.51 |
0,53-2,88 |
1,21 |
1,01 |
0,85 |
|
06.06 |
0,79-2,6 |
1,1 |
1,19 |
1,1 |
|
06.53 |
0,5-8,5 |
1,17 |
1,06 |
1,16 |
|
Образцы с положительным (резко положительным) ВА* |
|||||
05.36 |
0,53-3,42 |
1,12 |
1,06 |
1,8 |
|
06.38 |
0,32-5,3 |
1,25 |
1,38 |
1,03 |
|
07.06 |
0,7-4,3 |
1,41 |
1,74 |
1,84 |
|
06.21 |
0,36-4,6 |
1,15 |
1,44 |
1,04 |
|
07.40 |
0,61-4,05 |
1,42 |
1,58 |
1,40 |
Таблица 2. Коэффициент вариаций и количество лабораторий с определенным диагностическим выводом при исследовании пробы
№ образца |
КВ,% |
Отрицательный |
Погра- ничный |
Верояно полож. |
Положи- тельный |
Резко полож. |
Наш рез-т |
Образцы со слабо (вероятно) положительным ВА* |
|||||||
07.21 |
14,5 |
133 |
51 |
64 |
57 |
5 |
+ |
05.51 |
14,2 |
32 |
31 |
61 |
120 |
26 |
+ |
06.06 |
14,4 |
44 |
41 |
58 |
112 |
19 |
- |
06.53 |
39,3 |
57 |
46 |
56 |
111 |
14 |
- |
Образцы с положительным (резко положительным) ВА* |
|||||||
05.36 |
17,9 |
1 |
6 |
10 |
125 |
126 |
+ |
06.38 |
21,7 |
3 |
3 |
27 |
167 |
76 |
+ |
07.06 |
20,9 |
0 |
2 |
2 |
103 |
180 |
+ |
06.21 |
22,2 |
4 |
7 |
21 |
166 |
81 |
+ |
07.40 |
23,5 |
4 |
0 |
6 |
101 |
181 |
++ |
Анализ представленных в таблицах данных свидетельствует о том, что применение созданной тест-панели реагентов НПО РЕНАМ обеспечило получение значений нормализованных отношений (НО), не выходящих за пределы допустимых значений статистических данных ЕСАТ.
Из 9 исследованных опытных проб в 7 случаях полученные нами результаты совпадали с таковыми подавляющего количества участвующих лабораторий. В 2 пробах (06.06 и 06.53) проведенный нами анализ свидетельствовал об отсутствие в данных плазмах ВА. Обе пробы относились по конечной идентификации ЕСАТ к “слабо положительным” по титру ВА. Такой же вывод был сделан в 44 лабораториях по образцу 06.06 и в 57 лабораториях по образцу 06.53. Количество лабораторий с “отрицательным” диагнозом по отношению к числу лабораторий, характеризующих эти пробы как “положительные” и “резко положительные” составляло 33,6% и 45,6% для проб 06.06 и 06.53, соответственно. Необходимо отметить, что результаты анализа пробы 06.53 программой ЕСАТ характеризуются большим разбросом допустимых значений НО (0,5-8,5) и высоким коэффициентом вариации (39,3%). Эти процентные отношения и характер результатов, полученных лабораториями-участниками, указывают на то, что проведенный нами анализ указанных опытных проб не является грубо ошибочным и его “отрицательный” результат может быть обусловлен сложным гемостатическим составом исследуемых образцов плазмы.
Анализ всех данных ЕСАТ по двум группам анализируемых нами 9 проб: слабо (вероятно) положительные и положительные (резко положительные), свидетельствует о том, что значения коэффициента вариации не различается между данными группами (в среднем 20,1 и 21,2%, соответственно). Однако, соотношение количества лабораторий, характеризующих пробы с низким титром ВА как “отрицательные” и “положительные” равно 1:1,6. Данное отношение числа лабораторий при анализe проб с высоким содержанием ВА было равно 1:46. Этот факт указывает на сложность правильной диагностики больных с низким титром ВА в международном масштабе, что предполагает необходимость дальнейшего повышения качества определения ВА. В частности, большой процент лабораторий, идентифицирующих образцы с низким тит-ром ВА как “отрицательные” указывает на недостаточную чувствительность используемых ими реагентов. Данное положение, а также отсутст-вие утвержденной стандартизации состава и содержания фосфолипидов в диагностических панелях реагентов (во многом определяющих эффективность реагентов и методов диагностики) предполагают целесообразность разработок новых высоко чувствительных ВА-диагностикумов.
С использованием разработанной панели реагентов и общепринятого методического алгоритма была проведена диагностика ВА у 28 больных. Полученные во всех случаях результаты получили клиническое подтверждение.
Таким образом, данные Международного Внешнего Контроля Качества свидетельствуют о правильности диагностики ВА с помощью созданной панели реагентов (производство НПО РЕНАМ, Москва), так как полученные нами результаты преимущественно совпадали с таковыми большинства лабораторий-участников программы ЕСАТ.
РЕНАМ, НПО
125167, Москва, Новый Зыковский пр-д, д. 4а,
Гематологический Научный Центр РАМН
Тел./факс: (495) 614-90-57, 612-29-12,
E-mail: renam@blood.ru, www.renam.ru
Ведущий российский производитель и распространитель диагностических наборов и тест-систем для гемоглобинометрии и исследования системы гемостаза, а также контрольных материалов для гематологических анализаторов. Компания является поставщиком контрольных материалов для Федеральной системы внешней оценки качества лабораторных исследований МЗ РФ. Принимает активное участие в программе Международной службы внешнего контроля качества Великобритании по коагулологии.