При развитии эпидемии, вызванной новым коронавирусом в Китае, стала очевидной необходимость тестирования населения в беспрецедентных размерах в связи с высокой контагиозностью вируса SARS-CoV-2. Для этого сначала в Китае, а затем в Европе и США сотни государственных и частных организаций в срочном порядке занялись разработкой соответствующих диагностических тестов. Параллельно решались задачи в короткие сроки произвести, поставить в диагностические лаборатории тесты и организовать тестирование на уровне сотен тысяч анализов в неделю.

Проблемы, возникшие при этом, были сходными во всех странах, затронутых пандемией. На примере США – страны, проведшей наибольшее количество тестов, можно проследить основные пути решения задачи резкого увеличения объемов диагностики инфекционного заболевания.

1. основанные на амплификации и выявлении участков вирусного генома (PCR RT, LAMP др.) – наиболее широко используются в настоящее время, дают информацию о наличии вирусного генома в клинических образцах пациентов;

2. выявляющие специфические вирусные антигены с помощью специфичес-ких антител, дают информацию о наличии вирусных белков в клинических образцах пациентов;

3. на основе секвенирования, дают информацию о наличии вирусного генома и его изменениях с течением времени;

4. серологические, выявляют антитела к вирусу, дают информацию об иммунном ответе пациента на инфицирование вирусом.

В начале марта в США ряд национальных референс-лабораторий приступил к тестированию на коронавирус с помощью теста, который выявляет РНК возбудителя COVID19 на основе ПЦР РВ (цепная полимеразная реакция в реальном времени). Количество тестирований было на уровне лишь тысячи тестов в неделю.

В середине марта председатель BioReference Laboratories – крупнейшей диагностической компании, заявил, что лаборатория начнет проводить тесты на SARS-CoV-2, начиная с нескольких сотен тестов в день и расширяясь до “пары тысяч” в день на следующей неделе, “а затем, до 5 и 10 тысяч в день”. Действительно, масштабирование было проведено и это удалось сделать за счет автоматизации выделения РНК одновременно из сотен образцов, что позволило в течение следующих нескольких недель выйти на уровень более 10 тысяч в день.

Однако спрос продолжил расти и всплыла следующая проблема: для удовлетворения спроса потребовались дополнительные контрольно-измерительные приборы, получение которых может занять недели или месяцы. К примеру, ПЦР анализ, утвержденный CDC-Центром контроля инфекционных заболеваний США, выполняется на приборах Applied Biosystems 7500 Fast Dx или Thermo Fisher Scientific и нужно увеличить количество приборов. Однако нельзя просто пойти и купить сразу еще 10 приборов, поскольку потребуется не менее месяца, чтобы получить 7500 Fast Dx после размещения заказа. Выходом из этой ситуации стало привлечение к тестированию дополнительных лабораторий, в том числе частных, по всей стране, поскольку национальные референс-лаборатории не имели достаточных мощностей для удовлетворения спроса на тестирование наличия вируса SARS-CoV-2 у пациентов.

Кроме этого, основные лаборатории стали склоняться к диверсификации диагностических платформ, оборудования и реагентов как способу решения проблем масштабирования, связанных с зависимостью от одного производителя. На этом фоне для стимулирования разработок и внедрения в практику новых диагностикумов была применена практика облегчения процедуры выдачи разрешения на их использование от контрольных органов (т. н. “разрешения на экстренное использование” в короткие сроки были выданы FDA для нескольких десятков тестов различных производителей). С одной стороны, это привело к появлению на рынке множества новых тестов и приборов, что положительно сказалось на общей производительности диагностической индустрии, а с другой – породило проблему валидности многих тестов, не прошедших тщательной проверки.

Самые свежие разрешения на экстренное использование среди молекулярных тестов (т. е. тестов, в которых мишенью является специфический участок РНК генома коронавируса) получил тест-набор Aptima SARS-CoV-2 компании Hologic. Тест проводится на полностью автоматизированной платформе для молекулярной диагностики с высокой пропускной способностью, которая широко используется: более чем 1800 систем установлены в 60 странах. По словам представителя компании, одна система Panther может предоставить первоначальные результаты примерно за три часа и обработать более 1000 тестов на коронавирус за 24 часа. Медицинская технологическая компания из штата Массачусетс рассчитывает производить специфические реагенты для Panther примерно на 1 миллион анализов на коронавирус в неделю.

Подобный подход, основанный на использовании работающих на одной платформе диагностических систем, когда при необходимости нужно лишь заменить специфические компоненты, представляется чрезвычайно эффективным для быстрого реагирования на непредвиденные угрозы эпидемического характера.

Тестирование, использующее в качестве мишени антигены коронавируса, занимает относительно меньше места среди всей применяемой диагностики. Молекулярные тесты имеют преимущество амплификации, обеспечиваемой ПЦР, в то время как тесты на белковые антигены ограничены чувствительностью используемых антител. Это означает, что молекулярные тесты могут быть более чувствительными и способны диагностировать инфекцию на более раннем этапе процесса, чем белковые тесты. С другой стороны, тесты на антигены могут быть проще устроены и даже не требовать специального оборудования.

Разработки тестов на антигены SARS-CoV-2 интенсивно ведутся. В частности, такие диагностические фирмы, как Quidel, Roche и Becton Dickinson объявили, что разрабатывают тесты на антиген SARS-CoV-2. Президент OraSure заявил, что компания подала заявку на финансирование от BARDA в марте и получила контракт от агентства через неделю после подачи своего предложения. Ранее BARDA поддержала разработку OraSure экспресс-теста на антиген для лихорадки Эбола, в результате чего компания получила грант в размере до

10 млн долларов США в 2015 году. Тест был разработан и получил разрешение администрации США на применение в экстренных ситуациях. Компания планирует разработать тест на антиген SARS-CoV-2, который, как и ее тест на ВИЧ, будет пригоден для домашнего использования. Это будет иммунохроматографический тест, который может быть проведен “в уединении собственного дома менее чем за час”. Компания планирует запустить продукт с разрешения FDA в сентябре.

Компания BD находится в процессе разработки теста на антиген SARS-Cov-2 для своей системы иммуноанализа Veritor.

В настоящее время компания проводит испытания теста и представит тест в FDA в ближайшие несколько недель. BD инвестировала в производственные мощности, чтобы масштабировать производство теста в течение года на уровень миллион тестов в неделю.

Новые исследования по COVID-19, выявляющие достаточно высокие концентрации антигенов в образцах слюны и мазков из носа, открывают перспективу для разработчиков тестов на антигены. Также внедрение таких технологий как наномагнитные частицы и флуоресцентные метки временного разрешения обеспечивают возможность существенно повысить аналитическую чувствительность тестов на антигены. Так ожидается, что иммунохроматографический тест Nanomix будет иметь чувствительность “значительно выше 90 процентов”. OraSure также стремится к чувствительности и специфичности более 90% для своего теста. Он отметил, что тесты компании на ВИЧ, ВГС и Эболу имеют чувствительность и специфичность в этом диапазоне.

Быстрые тесты на антигены могут стать новой стратегией в борьбе с COVID-19. По сравнению с ПЦР-тестами, результаты которых могут занять около суток, тест Quidel дает результаты примерно через 15 минут. Исторически, однако, тесты на антигены гриппа и других заболеваний не были такими точными, как молекулярные тесты. В своих инструкциях по применению теста FIA Sofia 2 SARS Antigen Quidel пишет, что тест продемонстрировал 80-процентную клиническую чувствительность по сравнению с молекулярным тестом ПЦР и клиническую специфичность 100 процентов. Тест выполнен в формате иммунохроматографии с флуоресцентной детекцией и разрешен для использования с флуоресцентным иммуноанализатором Sofia 2.

Отдельно FDA заявило, что ожидает санкционирования большего количества тестов для обнаружения антигенов коронавируса и рассчитывает предоставить шаблон EUA для таких тестов, чтобы помочь разработчикам упростить подачу заявок и ускорить рассмотрение агентством и выпуск разрешения. На днях Тимоти Стенцель, директор Управления по диагностике при FDA, отметил, что агентство “очень воодушевлено тем, что есть ряд разработчиков, которые разрабатывают быстрые тесты на антигены, преимущество которых состоит в том, что они могут быть произведены в миллионах экземпляров и дают быстрый результат”.

Несколько академических и коммерческих лабораторий делают ставку на диагностические анализы путем секвенирования вирусного генома (анализ NGS), чтобы дополнить существующие варианты тестирования. Такие тесты, утверждают они, предоставляют дополнительную информацию, чтобы помочь отследить происхождение инфекции. По крайней мере, в одной китайской больнице анализ генома SARS-CoV-2 использовали, чтобы определить, произошла ли инфекция у работников здравоохранения изнутри или снаружи.

По состоянию на сегодня ни один диагностический анализ COVID-19 на основе секвенирования еще не получил Разрешение на экстренное использование от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США. Тем не менее, несколько лабораторий, в том числе Fulgent Genetics и Clear Labs представили заявки EUA для своих испытаний.

Эксперты считают, что платформы для NGS секвенирования могут быть полезны для диагностики, но основное их применение – поиск геномного разнообразия вируса SARS-CoV-2 среди разных пациентов и популяционных групп.

Первичный ответ антител при COVID-19 (IgM) происходит примерно через 4-9 дней после обнаружения вируса в крови. Его ответ достигает максимума примерно через девять дней, а с девяти до 28 дней ответ IgM исчезает. Ответ антител IgG является более устойчивым ответом и обычно обнаруживается через 12-14 дней после инфицирования. Для выявления антительного ответа у пациентов на коронавирус используют множество тестов в нескольких форматах, включая традиционные ИФА и ИХ, а также высокопроизводительные платформы для автоматических процессов. Решающее влияние на качество серотестов оказывает тип и состояние используемого вирусного антигена. Для диагностики антительного ответа при коронавирусной инфекции применяют два белковых антигена-нуклеокапсид (NC) и “спайк” (S), которые получают в виде рекомбинантных белков.

С момента начала пандемии предложено множество тестов в формате иммунохроматографии, часть которых позиционирована как тесты для самопроверки. В частности, тест BioSure COVID-19 готовят к выпуску в июне в Англии. Он не требует обучения и дает результаты теста через 10 минут. Британский Mologic также отметил, что материалы для его диагностических тестов поставляются в Институт Пастера де Дакар в Сенегале для производства тестов SARS-CoV-2 для Африки.

Другие свежие примеры. Недавно компания Biomerica заявила, что получила знак CE для своего экспресс-теста COVID-19 IgG / IgM для выявления антител к коронавирусу SARS-CoV-2. Калифорнийская фирма Irvine запустила тест, который дает результаты за 10 минут с анализом крови из пальца. Biomerica заявила, что версия одноразового серологического теста для больших объемов позволяет увеличить производство с помощью запатентованной системы карточек, которая устраняет необходимость в пластиковых футлярах. Тест предназначен для крупных клиентов, проводящих массовые скрининги.

Ряд задач по изучению популяционного иммунитета требует провести высокопроизводительное серологическое тестирование с высокой пропускной способностью, поскольку необходимо обследовать большие группы людей на наличие антител. Кроме того, для разработки и внедрения вакцин против COVID-19 важно уметь оценивать относительный уровень иммунного ответа в организме, чего можно достичь с помощью высокопроизводительных лабораторных машин.

Серологическая платформа фирмы Siemens Healthineers обнаруживает антитела как IgM, так и IgG на своих платформах иммуноанализа Advia Centaur и Atellica, эти три семейства анализаторов различаются по уровню автоматизации и производительности. В результате малые, средние и крупные больницы и референс-лаборатории могут выбирать анализаторы, которые лучше всего соответствуют их объемам тестирования, они могут быть подключены при необходимости для увеличения и удовлетворения определенного объема тестов. С уровнем чувствительности и специфичности, превышающим 99 процентов, Siemens ожидает, что его лабораторный тест на антитела превысит требования FDA. Недавно FDA выпустило новое руководство, которое уточняет свою позицию в отношении серологического тестирования во время пандемии COVID-19, сообщая разработчикам тестов на антитела, что им больше не будет разрешено просто уведомлять агентство, а вместо этого они должны подать заявку на EUA и соответствовать определенным пороговым показателям производительности.

Представитель фирмы считает, что существуют различные типы серологических анализов, и системы с высокой пропускной способностью от крупнейших производителей диагностики являются наиболее точными, а анализы, которые основаны на анализе крови и часто используют технологию ИХ в месте оказания медицинской помощи, наименее чувствительны. Клиницисты также используют платформы ELISA для проведения тестов на антитела, а исследовательские университеты и другие организации, разрабатывающие лабораторные тесты, часто используют эту технологию, но эта технология, к сожалению, “не поддается высокому уровню автоматизации”.

Другие эксперты считают, что различные платформы серотестирования должны сосуществовать, поскольку предназначены для различных условий и целей.

ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора

Федеральное бюджетное учреждение науки “Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии” Роспотребнадзора

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск •

Тел.: +7 (4967) 36-00-03, +7 (4967) 36-00-10

e-mail: info@obolensk.org • www.obolensk.org, www.sredy-obolensk.ru