"СОВРЕМЕННАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА" №3 2018 г.

Скачать издание (pdf)

Листать издание (pdf-вьювер)

Информация для рекламодателей (pdf)

САЙТ МЕДРЕЕСТР - УДОБНЫЙ ПОИСК МЕДТЕХНИКИ И ТОРГУЮЩИХ ФИРМ


Лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов с использованием современных питательных сред

Подкопаев Я. В., Домотенко Л. В., Морозова Т. П., Шепелин А. П.

Федеральное бюджетное учреждение науки

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора

Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) – тяжёлые инфекционные заболевания, которые могут быть вызваны широким спектром микроорганизмов, но основными этиологическими агентами расшифрованных случаев ГБМ, являются Neisseria meningitidis (менингококк), Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Haemophilus influenzae (гемофильная палочка). Несмотря на совершенствование методов диагностики, согласно данным Российского референс-центра по мониторингу, за бактериальными менингитами, более половины случаев ГБМ остаются нерасшифрованными [1; 2].

Лабораторная диагностика ГБМ

Лабораторная диагностика ГБМ и других заболеваний, вызываемых N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, является неотъемлемой составляющей для своевременной и правильной постановки диагноза и назначения адекватного лечения. Вместе с тем, лабораторные исследования могут проводиться не только с диагностической, но и с профилактической целью, а также по эпидемиологическим показаниям. По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией, а с профилактической целью – здоровые контингенты с целью слежения за циркуляцией менингококка среди населения [3; 4].

Учитывая особенности ГБМ, связанные с полиэтиологичностью возбудителей и тяжелейшим протеканием болезни, лабораторная диагностика требует сочетания классических и экспресс-методов при идентификации возбудителей.

К классическим методам диагностики относится культуральный посев образцов клинического материала на питательные среды. В действующих на территории Российской Федерации нормативных документах по диагностике заболеваний, вызываемых N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, именно этому методу отдаётся предпочтение [3; 5; 6]. Среди экспресс-методов наиболее часто используются микроскопия ликвора или крови, реакция латекс-агглютинации и методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1; 7; 8].

Концентрация микроорганизмов в ликворе при ГБМ может варьироваться от 6х103 до 108 клеток/мл, а чувствительность микроскопии составляет 104 клеток/мл [9], поэтому при исследовании клинических образцов этот метод имеет лишь ориентировочное значение и может быть использован только для предварительной постановки диагноза [6].

Сравнительное исследование различных методов выявления возбудителей бактериальных менингитов показало, что латекс-агглютинация уступает по чувствительности культуральному методу и может давать не только ложноотрицательные, но и ложноположительные результаты. Однако из-за простоты и высокой скорости получения результатов используется в качестве вспомогательного лабораторного теста [10].

В ряде исследований доказана высокая чувствительность метода ПЦР при диагностике ГБМ [11; 12]. В настоящее время существует несколько коммерческих ПЦР тест-систем, но они предназ-

начены только для обнаружения трех основных возбудителей ГБМ и не могут идентифицировать возбудителей ГБМ других видов [13; 14].

Особенности культурального метода

Метод посева клинического материала на бактериологические питательные среды из-за простоты, доступности и достаточно высокой чувствительности занимает одно из основных мест в схеме лабораторной диагностики ГБМ. Поскольку этот метод позволяет достоверно подтвердить наличие возбудителя, он до сих пор считается “золотым стандартом” в лабораторной диагностике ГБМ.

Чувствительность культурального метода зависит от ряда факторов. Во-первых, частота выделения этиологических агентов значительно снижается, если клинический материал для исследования был взят после антибиотикотерапии. Во-вторых, немаловажное значение имеет время между взятием клинического образца и проведением бактериологического посева, поэтому рекомендуется проводить первичный посев сразу же после взятия образца у постели больного или доставить клинический материал в лабораторию не позднее 1 ч после взятия [7]. И, в-третьих, успех выделения возбудителя зависит от выбора и качества питательных сред.

Основные этиологические агенты ГБМ отличаются высокой требовательностью к составу питательных сред. Для роста гемофильной палочки необходимо наличие в питательной среде факторов роста – X (гемин или гематин) и V (никотинамидадениндинуклеотид – НАД). Для культивирования менингококков и пневмококков требуются среды, содержащие кровь или сыворотку крови животных. Поэтому для выделения и культивирования этих микроорганизмов необходимо использовать специальные среды, обогащённые ростовыми добавками, кровью или сывороткой крови.

Питательные среды для диагностики ГБМ

Согласно действующим нормативным документам для выделения и культивирования основных возбудителей ГБМ в отечественной клинической практике используются шоколадный, сывороточный и кровяной агары [3; 6; 13]. При этом универсальной питательной средой, на которой успешно выделяют большинство возбудителей ГБМ, является шоколадный агар [6; 14].

Для приготовления шоколадного агара в качестве основы может быть использован агар Хоттингера, колумбийский агар, агар для бруцелл, эритрит-агар, сердечно-мозговой агар, гонококковый агар и некоторые другие среды [3; 7, с. 283–290]. Подобное разнообразие основ может негативно влиять на воспроизводимость результатов исследований.

Биологические показатели шоколадного и кровяного агаров напрямую зависят от качества и типа используемой крови. Для приготовления этих сред традиционно используют дефибринированную кровь барана, лошади, крупного рогатого скота [3]. Человеческая кровь не пригодна для приготовления кровяного агара из-за того, что она может содержать антибиотики, антитела и другие антибактериальные агенты [7, с. 40; 15]. Большое влияние на качество питательных сред с кровью оказывают практические навыки лаборантов при приготовлении сред в лабораториях. Например, при недостаточно точном соблюдении температурного и временного режимов при приготовлении шоколадного агара содержащиеся в крови ферменты НАДазы и НАДФазы могут остаться в питательной среде в активном состоянии, и такая среда не сможет обеспечить потребность H. influenzae в факторе роста V.

Во избежание этого рекомендуют дополнительно вносить в шоколадный агар НАД в концентрации до 15 мкг/мл или коммерческие ростовые добавки (PolyVitex, IsoVitaleX и др.) [16].

Ряд иностранных фирм-производителей питательных сред выпускают коммерческие шоколадные агары в готовом к применению виде (в чашках Петри). Выпускаются также основы питательных сред во флаконах или в сухом виде, при приготовлении которых не требуется добавления крови, а достаточно использовать сухие компоненты крови (гемоглобин или гемин) и НАД [17-19].

Питательные среды производства ФБУН ГНЦ ПМБ для диагностики ГБМ

Во ФБУН ГНЦ ПМБ разработаны и выпускаются четыре питательные среды для культивирования и выделения основных возбудителей ГБМ: Менингоагар, Гемофилус агар, Шоколадный агар и ГБМ-агар.

Менингоагар – сухая питательная среда для выделения и культивирования менингококков. Питательная среда не требует дополнительного внесения крови или сыворотки и обеспечивает рост культур N. meningitidis через 18-24 ч при высеве единичных клеток. В схеме лабораторной диагностики ГБМ эта среда может быть использована как в качестве заменителя сывороточного агара, так и его основы.

Гемофилус агар – питательная среда для культивирования и выделения гемофильной палочки, готовая к применению во флаконах. Обеспечивает рост штаммов H. influenzae через 18-24 ч инкубации при высеве единичных клеток. Гемофилус агар представляет собой набор из питательной основы, ростовой и селективной добавок. Гемофилус агар содержит факторы роста X и V, необходимые для роста бактерий рода Haemophilus, а использование селективной добавки позволяет выделять H. influenzae из контаминированного материала.

Шоколадный агар – питательная среда для выделения всех трёх основных возбудителей ГБМ готовая к применению (Рис.1). Шоколадный агар выпускается в виде набора, состоящего из основы питательной среды – 4 флакона, ростовой добавки (РД-ША) – 4 флакона и по одному флакону каждой из трёх селективных добавок: для выделения гемофильной палочки (СД-Г), пневмококка (СД-П) и менингококка (СД-М). Использование селективных добавок при исследовании ликвора и крови нецелесообразно, так как эти жидкости в норме стерильны и любой выделенный из них микроорганизм будет считаться возбудителем заболевания. При исследовании контаминированного посторонней микрофлорой материала, например, мазков из зева, использование селективных добавок может значительно повысить выявляемость искомых микроорганизмов. Шоколадный агар удобен в применении, так как не требует дополнительной стерилизации. Для его приготовления достаточно расплавить содержимое флакона с основой питательной среды, растворить и добавить в основу содержимое флакона с РД-ША, а при необходимости и содержимое одного из флаконов с селективной добавкой, после чего разлить питательную среду в чашки Петри.

ГБМ-агар – сухая питательная среда, которая, как и Шоколадный агар, предназначена для выделения основных возбудителей бактериальных менингитов. ГБМ-агар представляет собой набор реагентов, состоящий из основы питательной среды и ростовой добавки. В связи с тем, что этот набор выпускается в сухом виде, срок его годности составляет два года, что в два раза превышает срок годности Шоколадного агара.

Шоколадный агар и ГБМ-агар обеспечивают рост H. influenzae, N. meningitidis и S. pneumoniae через 18-24 ч инкубации при высеве единичных клеток. Обе питательные среды обладают дифференцирующими свойствами в отношении пневмококка: на Шоколадном агаре в зоне роста S. pneumoniae цвет среды изменяется с коричневого на зеленовато-жёлтый, а на ГБМ-агаре – происходит обесцвечивание среды (Рис. 2).

В схеме лабораторной диагностики бактериальных менингитов каждая из этих двух сред может быть использована в качестве замены шоколадного агара с гретой кровью. Шоколадный агар и ГБМ-агар обеспечивают рост и других требовательных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis, Klebsiella pneumoniae, Listeria spp., Moraxella catarrhalis и др.).

В ходе ряда исследований определены биологические характеристики питательных сред для выделения основных возбудителей ГБМ с использованием различных методов. Культуральные и морфологические свойства музейных штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae различных серогрупп, после культивирования на разработанных питательных средах не изменялись и были типичными для этих видов микроорганизмов. В мазках, окрашенных по Гинсу, у всех капсульных штаммов исследованных микроорганизмов наблюдали наличие капсулы. Реакция латекс-агглютинации с соответствующими типоспецифическими сыворотками у всех исследованных штаммов, выращенных на Менингоагаре, Гемофилус агаре, Шоколадном агаре и ГБМ-агаре, давала положительный результат.

В ходе исследований структурных характеристик бактерий методами сканирующей электронной микроскопии выявлено, что культивирование штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae на питательных средах не влияет на структурные характеристики клеток и не изменяет их морфологию. Проведенные исследования подтвердили стабильность биологических свойств микроорганизмов, выращенных на разработанных средах.

Проведены сравнительные испытания питательных сред ФБУН ГНЦ ПМБ, сред аналогичного назначения иностранного производства и сред лабораторного приготовления с использованием музейных штаммов и клинических образцов (ликвора от больных с подозрением на гнойный бактериальный менингит и мазков из зева от пациентов с заболеваниями верхних дыхательных путей). Показано, что Менингоагар, Гемофилус агар, Шоколадный агар и ГБМ-агар по ростовым свойствам не только не уступают средам сравнения, но и превосходят по чувствительности и скорости роста шоколадные агары лабораторного приготовления [20; 21]

Гемофилус агар, Шоколадный агар и ГБМ-агар зарегистрированы в качестве изделий медицинского назначения, а Менингоагар находится на завершающей стадии Государственной регистрации в Росздравнадзоре и в настоящее время выпускается только для научных целей.

Таким образом, все четыре разработанные питательные среды – Менингоагар, Гемофилус агар, Шоколадный агар и ГБМ-агар – могут быть внедрены в схему лабораторной диагностики ГБМ и других инфекций, вызываемых N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae, что позволит увеличить долю импортозамещающих питательных сред в отечественной клинической микробиологии и повысить эффективность диагностики инфекционных болезней.

Литература

1. Королева И. С. Принципы лабораторной диагностики генерализованных форм менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов / И. С. Королева, Г. В. Белошицкий, Т. А. Тагаченкова // Медицинский алфавит. – 2009. – Т. 1, № 2. – С. 23–28.

2. Королева, И. С. Результаты эпидемиологического мониторинга бактериальных менингитов на территории Российской Федерации / И. С. Королева, Г. В. Белошицкий, И. М. Закроева, М. А. Королева // Медицинский алфавит. – 2013. – Т. 1, № 5. – С. 8–10.

3. МУК 4.2.1887-04. Методические указания. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. – М., 2005. – 48 с.

4. Краева Л. А. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов / Л. А. Краева // Инфекция и иммунитет. – 2011. – Т. 1, № 1. – С. 51–58.

5. МУК 4.2.3115–13. Методические указания. Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний. – М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2014. – 39 с.

6. Приказ Минздрава РФ от 23.12.98 г. N 375 “О мерах по усилению эпи демиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов”. – М., 1998.

7. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual [Электронный ресурс]. – 2-е изд. – Geneva: World Health Organization, 2011. – 311 с. – Режим доступа: http://www.who.int/iris/handle/10665/70765 (дата обр. 21.03.2016).

8. Bahr N. C. Methods of rapid diagnosis for the etiology of meningitis in adults / N. C. Bahr, D. R. Boulware // Biomarkers. – 2014. – Vol. 8, no. 9. – P. 1085–1103.

9. La Scolea L. J. Quantitation of bacteria in cerebrospinal fluid and blood of children with meningitis and its diagnostic significance. / L. J. La Scolea, D. Dryja // Journal of Clinical Microbiology. – 1984. – Vol. 19, no. 2. – P. 187–190.

10. Utility of latex agglutination test (LAT) in detecting acute bacterial menin gitis against culture as gold standard / R. Jyothi, J. T. R. Bai, [et al.] // Journal of The Academy of Clinical Microbiologists. – 2015. – Vol. 17, no. 2. – P. 84–88.

11. Hmood B. A. Comparison between Gram s stain, culture, Real–time PCR for diagnosis of Neisseria meningitidis in CSF Cases / B. A. Hmood, A. N. Hussein, L. F. Manher // International Journal of Advanced Research. – 2015. – Vol. 3, no. 5. – P. 658–664.

12. Wu, H. M. Accuracy of real-time PCR, Gram stain and culture for Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae meningitis diagnosis [Электронный ресурс] / H. M. Wu [и др.] // BMC Infectious Diseases. – 2013. – Т. 13, № 1. – С. 26. – Режим доступа:

http://bmcinfectdis.biomedcentral.com/articles/

10.1186/1471-2334-13-26 (дата обр. 22.09.2018).

13. МУ 3.1.2.2516-09. Методические указания. Эпидемиологический надзор за менингококковой инфекцией. – М., 2009.

14. Королева, И. С. Этиология и лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов / И. С. Королева, Г. В. Белошицкий, И. Н. Лыткина, Г. Чистякова, В. Л. Заикин, Н. Малышев, Л. Я. Соловьева, Т. Я. Липчанская // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2005. – № 3. – С. 5–9.

15. Russell, F. M. As a bacterial culture medium, citrated sheep blood agar is a practical alternative to citrated human blood agar in laboratories of developing countries / F. M. Russell, S. S. N. Biribo, G. Selvaraj, F. Oppedisano, S. Warren, A. Seduadua, E. K. Mulholland, J. R. Carapetis // Journal of Clinical Microbiology. – 2006. – Vol. 44, no. 9. – P. 3346–3351.

16. Богданович, Т. М. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae / Т. М. Богданович, О. У. Стецюк, О. И. Кречикова, Л. Г. Боронина, Л. К. Катосова, М. Е. Фаустова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2000. – Т. 2, № 2. – С. 93–109.

17. Difco & BBL manual: manual of microbiological culture media / ed. by M. J. Zimbro, D. A. Power, S. M. Miller, G. E. Wilson, J. A. Johnson. – 2nd ed. – BD Diagnostic Systems, 2009.

18. Набор для приготовления шоколадного агара [Электронный ресурс] / HiMedia. – Режим доступа: http : / / www. himedialabs . ru / sm103h (дата обр. 17.09.2018).

19. Chocolate agar [Электронный ресурс] / ThermoFisher scientific. – Режим доступа: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/IFU1300.pdf (дата обр. 17.09.2018).

20. Подкопаев, Я. В. Отечественные питательные среды для диагностики гнойных бактериальных менингитов / Я. В. Подкопаев, Л. В. Домотенко, Т. П. Морозова, М. В. Храмов, А. П. Шепелин // Клиническая лабораторная диагностика. – 2015. – № 5. – С. 59–64.

21. Подкопаев, Я. В. Сравнительная оценка питательных сред для выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов / Я. В. Подкопаев, Л. В. Домотенко, А. Н. Круглов, И. В. Рябченко, К. В. Детушев, Т. П. Морозова, А. П. Шепелин // Инфекция и иммунитет. – 2016. – Т. 6, № 4. – С. 389–394.

ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора

Федеральное бюджетное учреждение науки “Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии” Роспотребнадзора

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск • Тел.: +7 (4967) 36-00-03, +7 (4967) 36-00-10

e-mail: info@obolensk.org • www.obolensk.org, www.sredy-obolensk.ru