Одной из основных функций лабораторий клинической микробиологии является определение чувствительности клинически значимых бактериальных изолятов к антимикробным препаратам. Результаты определения используются при выборе этиотропной терапии для лечения конкретного пациента. Они необходимы также для получения эпидемиологических данных о структуре резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций, которые впоследствии становятся основой для эмпирического назначении антимикробных препаратов.

Актуальность определения чувствительности в современных условиях особенно возрастает в связи со сложившейся ситуацией, связанной с распространением патогенных и условно патогенных микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней, устойчивых к антимикробным препаратам, включая антибиотики. В арсенале врачей практически не остается препаратов выбора: устойчивость возникла даже к карбапенемам, которые являются самыми эффективными препаратами при лечении инфекций, вызываемых устойчивыми анаэробами и энтеробактериями.

Устойчивость к антимикробным препаратам – многогранная проблема, касающаяся всего общества и определяемая множеством взаимосвязанных факторов. Отдельные изолированные усилия малоэффективны. Для борьбы с развитием и распространением устойчивости к антимикробным препаратам необходимы согласованные действия. Появление и распространение антибиотикоустойчивых бактерий усугубляется неправильным назначением и применением антибиотиков. Последствия необоснованного назначения антибиотиков могут навредить не только пациенту (практически 40% всех сообщений о побочных эффектах связаны именно с приемом антибактериальных препаратов), но и всему обществу. Стремительный рост резистентности микробов к существующим лекарственным средствам может оставить будущие поколения без этих лекарств [1-2].

От микробиологов требуется грамотное выполнение всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов. Исследования, проведенные американскими учеными, показали, что правильное и своевременное выполнение оценки чувствительности микроорганизмов способствует улучшению результатов лечения пациентов путем быстрого обнаружения резистентности и последующего выбора подходящих антимикробных препаратов [3]. До сих пор не существует достаточно быстрого диагностического теста для выбора препарата непосредственно у постели больного.

В настоящее время увеличивается количество лабораторий, которые применяют молекулярно-генетические методы исследования, основанные на обнаружении специфических генетических маркеров резистентности к антимикробным препаратам. Преимуществом этих методов является высокая скорость получения результатов и высокая стандартность. В литературе обсуждаются вопросы использования масс-спектрометрии и проточной цитометрии для обнаружения резистентности, что позволит сократить время исследования до 1-2 ч. Вибрационные кантилеверы, содержащие бактериальные клетки, являются еще одной новой методологией для выявления устойчивости к противомикробным препаратам [4]. Изотермическая микрокалориметрия применена для обнаружения действия антивомикробных препаратов на бактерии в биопленках [5]. Новым подходом к обнаружению и количественной оценке устойчивости к противомикробным препаратам является использование биосенсоров с покрытыми антителами магнитными микросферами, а также автоматизированной микроскопии иммобилизованных живых бактериальных клеток для обнаружения их роста в присутствии антимикробных препаратов [6-7]. Шведские ученые, применяя специально изготовленный микрофлюидный чип и регистрируя с помощью микроскопа темпы роста бактерий в присутствии антибиотиков, смогли определить чувствительность уропатогенных изолятов Escherichia coli к девяти антибиотикам менее чем за 30 минут [8]. Перечисленные методы, за исключением молекулярных методов – это методы следующего поколения. Многие лаборатории во всем мире для сокращения времени получения результата переходят на автоматический или полуавтоматический формат исследования, используя автоматизированные системы для идентификации и определения чувствительности.

В микробиологических лабораториях нашей страны представлены автоматические бактериологические анализаторы Phоenix (Becton Dickinson), VITEK2 (bioMerieux), WalkAway (Beckman Coulter), Sensititre (Thermo Scientific). Эти новые системы позволяют проводить идентификацию микроорганизмов в среднем за 6-8 ч и определение их чувствительности к антибактериальным препаратам в среднем за 4-10 ч в зависимости от рода микроорганизмов. Тестируемый спектр включает в себя более 200 микроорганизмов. Определение чувствительности проводится к большому числу препаратов (от 18 до 36) в нескольких концентрациях. Результаты могут быть получены как в виде клинических категорий (чувствительный – умеренно-чувствительный – резистентный), так и в виде значений минимально подавляющей концентрации (МПК).

При многочисленных положительных характеристиках использование анализаторов имеет ряд ограничений, связанных, в первую очередь, с тем, что панели (или кассеты) для автоматов содержат фиксированный набор антимикробных препаратов для конкретных групп микроорганизмов, и, во-вторых, невозможно тестировать медленно растущие бактерии. Для них необходимо оценивать чувствительность дополнительными методами: диско-диффузионным или с помощью Е-тестов. Тем не менее, несмотря на высокую цену, перспектива их использования в многопрофильных стационарах очевидна в связи с большим количеством исследований.

Хромогенные среды разработаны около тридцати лет назад для выделения и быстрой идентификации микроорганизмов. Они созданы таким образом, что идентифицируемый микроорганизм в процессе роста с помощью собственных специфических ферментов гидролизует хромогенный субстрат, в результате расщепления которого образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате колонии микроорганизмов окрашиваются в определенный цвет или приобретают способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении.

В последние годы перечень хромогенных сред дополнился средами для скрининга возбудителей инфекций со специфическими фенотипами антибиотикорезистентности. Несколькими компаниями производятся хромогенные среды для обнаружения патогенов со следующими специфическими детерминантами резистентности: MRSA (устойчивый к метициллину S. aureus), VRE (устойчивые к ванкомицину Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis), ESBL (продуцирующие β-лактамазу расширенного спектра Enterobacteriaceae и другие грамотрицательные палочки, устойчивые к цефалоспоринам третьего поколения) и CRE (устойчивые к карбапенем Enterobacteriaceae и другие грамотрицательные палочки). Отличительная особенность при работе с данными средами заключается в необходимости предварительного накопления патогена в бульоне, содержащем один или несколько селективных агентов (например, антибиотиков, NaCl). Среды данного назначения не нашли столь широкого применения в нашей стране, но в литературе описано их использование, как при анализе клинического материала, так и пищевых продуктов [9]. Например, при сравнительном исследовании хромогенных сред для выявления MRSA трех производителей их чувствительность находилась в пределах 83,6-89,0%, а специфичность – 92,1-98,6% [10]. Чувствительность и селективность сред для обнаружения VRE варьировалась от 80 до 98,6% в зависимости от фирмы-изготовителя, а специфичность – от 79,4 до 100% [11].

Золотым стандартом определения чувствительности остается метод последовательных разведений в бульоне, регламентированный международным стандартом ISO 20776-1:2006 и ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Описанию методики проведения тестирования посвящено много публикаций. Здесь только отметим, что все вновь разрабатываемые методы и системы при регистрации проходят оценку в сравнительных исследованиях именно с данным методом. FDA в США даже разработала требования к специальным критериям сравнения при внедрении новых систем. Так, например, частота обнаружения очень больших ошибок (ложная чувствительность) должна составлять <1,5% для тестируемых изолятов, а основные ошибки (ложная устойчивость) должны составлять <3%, а категориальное совпадение с эталонным методом должно составлять ≥ 90% для каждого противомикробного препарата и микроорганизма [3].

Диффузионные методы – наиболее широко используемые методы – объединяют диско-диффузионный метод (ДДМ) и метод градиентной диффузии антимикробных препаратов в агар. Диффузионные методы традиционно выполнялись вручную, но в течение последних двух десятилетий разработаны полуавтоматические коммерческие устройства для регистрации результатов как для ДДМ, так и для метода градиентной диффузии.

Метод градиентной диффузии для тестирования чувствительности, в нашей стране известный как метод Е-тестов или эпсилометрический метод, выполняется с помощью стандартных пластиковых полосок. На нижней поверхности полосок нанесен антимикробный препарат с экспоненциально убывающим градиентом концентрации (примерно 15 концентраций), например, от 256 до 0,016 мкг/мл. На верхней поверхности полосок нанесена шкала значений МПК. Первые полоски выпускались под названием Etest фирмой AB Biodisk (затем bioMérieux), в последние годы появились полоски MIC Evaluator (M.I.C.E.) (Oxoid). Процедура тестирования с помощью полосок заключается в размещении полосок на агаровую среду (как правило, агар Мюллера-Хинтон), засеянных стандартной суспензией тестируемого микроорганизма (108 КОЕ/мл), аналогичной той, которая используется в процедуре диско-диффузионного метода. Через 16-18 ч инкубации при температуре 35°С образуется зона подавления роста микроорганизма в виде эллипса из-за градиента концентраций антибиотика. Подавление роста вокруг полоски происходит только в той зоне, где концентрация антибиотика выше МПК. Значение МПК регистрируется на пересечении эллипсовидной зоны подавления роста с краем полоски. По полученным значениям МПК, используя интерпретационные таблицы, определяют клиническую категорию тестируемого штамма. Многочисленные исследования антибиотикочувствительности большого набора грамположительных и грамотрицательных бактерий, проведенные с использованием Etest, продемонстрировали хорошее совпадение результатов с референтным методом микроразведений в бульоне [12-14].

Метод градиентной диффузии антимикробных препаратов в агар при сравнительной простоте использования позволяет получать количественные данные, тестировать широкий набор микроорганизмов, включая микроорганизмы со сложными питательными потребностями (стрептококки, пневмококки, гемофилы, гонококки, анаэробы и др.), но из-за дороговизны не получил широкого распространения.

Диско-диффузионный метод является одним из старейших и остается наиболее используемым методом оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам в обычных бактериологических лабораториях. Он подходит для исследования большинства бактериальных патогенов, в том числе и для наиболее распространенных бактерий со сложными питательными потребностями. Метод является универсальным для широкого круга антимикробных препаратов и не требует обязательного использования специального оборудования.

Для получения достоверных результатов необходимо четко следовать методике, описанной в нормативных документах. До 2014 года единственным документом, регламентирующим процедуру тестирования, являлись “Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам” МУК 4.2.1890-04, которые базируются на требованиях стандарта M100 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute – Институт клинических и лабораторных стандартов, США).

В соответствии с требованиями МУК 4.2.1890-04 для тестирования чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом можно использовать любую среду данного назначения, разрешенную к применению на территории РФ. Для микроорганизмов с обычными питательными потребностями это могут быть среды: АГВ, питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, Мюллера-Хинтон агар (МХА), изосенситест и др. Для микроорганизмов со сложными питательными потребностями рекомендуются две питательные среды: специальная питательная среда Haemophilus Test Medium – для тестирования H. influenzae, а для остальных (Streptococcus pneumoniae, стрептококки групп A, B, C, G, и др.) – МХА с добавлением 5% бараньей крови.

В 2014 г. утверждены клинические рекомендации “Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам”, которые ориентированы на методологию в оценке чувствительности и интерпретации результатов, предлагаемую Европейским комитетом по определению чувствительности к антимикробным препаратам (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST) и являются переводом документов EUCAST. В соответствии с требованиями клинических рекомендаций для анализа чувствительности микроорганизмов с обычными питательными потребностями может быть использована только одна питательная среда. Этой средой является агар Мюллера-Хинтон. Для тестирования микроорганизмов со сложными питательными потребностями рекомендована единая среда для Streptococcus spp. и для Haemophilus influenzae, и др. – агар МХА с добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови и 20 мг/л β-никотинамидадениндинуклеотида (β-НАД).

Три года, прошедшие после утверждения обсуждаемых клинических рекомендаций, на наш взгляд, стали переходными. В этот период многие лаборатории стали постепенно внедрять в свою практику требования клинических рекомендаций. Но еще много лабораторий работают по требованиям МУК 4.2.1890-04. Конечно, ряд технических трудностей, связанных, в основном, со сложностью приобретения агара Мюллера-Хинтон надежных фирм-производителей в период экономического кризиса и отсутствием на российском рынке доступной лошадиной крови, ограничивал использование нового нормативного документа.

В настоящее время ситуация меняется. Уже стала доступна дефибринированная лошадиная кровь как отечественного, так и импортного производства. В ФБУН ГНЦПМБ разработана технология производства агара Мюллера-Хинтон II и организовано его производство. Питательная среда зарегистрирована как медицинское изделие в Росздравнадзоре (РУ № РЗН 2017/5962).

Несмотря на большое количество методов, на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. В то же время, результаты определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии. Выбор методов определения определяются традициями и возможностями каждой отдельной лаборатории.

1. WHO (April 2014). "Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014". WHO. Retrieved May 9, 2015.

2. Домотенко, Л.В. Лабораторная диагностикачувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам / Л.В. Домотенко, А.П. Шепелин // Справочник заведующего КДЛ. – 2017. – № 8. – С. 8-16.

3. Manual of Commercial Methods in Clinical Microbiology: International Edition, Second Edition, Allan L. Truant (Editor-in-Chief). – Wiley-Blackwell – 2016. – 612 p.

4. van Belkum, A. Next-generation antimicrobial susceptibility testing / A. van Belkum, W. M. Dunne // Journal of Clinical Microbiology. – 2013. – V. 51. – P. 2018–2024.

5. Von Ah, U. Isothermal micro-calorimetry – a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of Escherichia coli and Staphylococcus aureus / Ah. U. Von, U., D. Wirz, A. U. Daniels. – BMC Microbiology. – 2009. – V. 9: 106. doi: 10.1186/1471-2180-9-106.

6. Kinnunen, P. Self-assembled magnetic bead biosensor for measuring bacterial growth and antimicrobial susceptibility testing / P. Kinnunen, B. H. McNaughton, T. Albertson, I. Sinn, S. Mofakham, R. Elbez, D. W. Newton, A. Hunt, and R. Kopleman // Small. – 2012. – V. 8. – P. 2477–2482.

7. Price, C. S. Rapid antibiotic susceptibility phenotypic characterization of Staphylococcus aureus using automated microscopy of small numbers of cells / C.S. Price, S. E. Kon, S. Metzger // Journal of Microbiological. Methods – 2014. – V. 98. – P. 50–58.

8. Baltekina, Ö. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging / Ö. Baltekina, A. Boucharina, E. Tanob, D. I. Anderssonc, J. Elf // PNAS. – 2017. – V. 114, N. 34. – p. 9170–9175.

9. Randall, L.P. Evaluation of meat, fruit and vegetables from retail stores in five United Kingdom regions as sources of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing and carbapenem-resistant Escherichia coli / L.P. Randall, M.P. Lodge, N.C. Elviss, F.L. Lemma, K.L. Hopkins, C.J. Teale, N. Woodford // International Journal of Food Microbiology. – 2017. – V. 16, No. 241. – P.283-290.

10. Denys, G. A. Three way comparison of BBL CHROMagar MRSA II, MRSASelect, and Spectra MRSA for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in nasal surveillance cultures / G.A. Denys, P.B. Renzi, K.M. Koch, and C.M. Wissel. // Journal of Clinical Microbiology. – 2013. – V. 51. – P. 202–205.

11. Johnson, J. K. Current rapid screening methods for gastrointestinal colonization of vancomycin-resistant enterococci / J. K. Johnson, D. Cashara // Clinical Microbiology Newsletter. – 2013. – V. 35. – P. 45–51.

12. Luber, P. Comparison of Broth Microdilution, E Test, and Agar Dilution Methods for Antibiotic Susceptibility Testing of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli / P. Luber, E. Bartelt, E. Genschow, J. Wagner, H. Hahn // Journal of Clinical Microbiology. – 2003. – V. 41, No. 3. P. 1062–1068.

13. Mayrhofer, S. Comparison of Broth Microdilution, Etest, and Agar Disk Diffusion Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Lactobacillus acidophilus Group Members //S. Mayrhofer, K. J. Domig, C. Mair, U. Zitz, G. Huys, W. Kneifel // Applied and Environmental Microbiology. – 2008. – V. 74, No.12. – P. 3745–3748.

14. Amsler, K. Comparison of Broth Microdilution, Agar Dilution, and Etest for Susceptibility Testing of Doripenem against Gram-Negative and Gram-Positive Pathogens / K. Amsler, C. Santoro, B. Foleno, K. Bush, R. Flamm // Journal of Clinical Microbiology. – 2010. – V. 48, No. 9. – P. 3353-3357.

Федеральное бюджетное учреждение науки “Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии” Роспотребнадзора

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск • Тел.: +7 (4967) 36-00-03, +7 (4967) 36-00-10

e-mail: info@obolensk.org • www.obolensk.org, www.sredy-obolensk.ru