Марданлы Сейфаддин Гашимович – профессор кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ГОУ ВО МО “Государственный гуманитарно-технологический университет”, президент и директор по науке ЗАО “ЭКОлаб”, доктор медицинских наук, академик АМТН, Заслуженный работник здравоохранения Российской Федерации; ekolab-president@mail.ru.

Арсеньева Вероника Алексеевна – старший микробиолог отдела перспективных разработок ЗАО “ЭКОлаб”, ecolab.arsenyeva@gmail.com.

Амелина Елена Анатольевна – начальник отдела перспективных разработок ЗАО “ЭКОлаб”; ekolab-ferment@mail.ru.

Марданлы Сархан Сейфаддинович – младший научный сотрудник ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии имени почетн. акад. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России, директор по развитию ЗАО “ЭКОлаб”, ekolab-sarkhan@mail.ru.

Ротанов Сергей Владимирович – ведущий научный сотрудник Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения Москвы, научный консультант ЗАО “ЭКОлаб”, доктор медицинских наук, доцент; svrotanov@mail.ru.

Разработан новый оригинальный отечественный набор реагентов “Лайн-Блот ВГЧ-профиль” (комплект № 1 – IgG и комплект № 2 – IgM) для определения в формате линейного иммуноблоттинга антител к основным возбудителям герпесвирусных инфекций (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV). Проведены доклинические испытания с использованием 319 сывороток крови ВИЧ-инфицированных (128 шт.), беременных (86 шт.) и лиц, проходивших лечение или диагностическое обследование (105 шт.). В отношении каждой инфекции проведены исследования в ИФА и линейном иммуноблоттинге с новым набором и его аналогами германского производства, что позволило оценить диагностическую информативность разработанного набора по ГОСТ Р 53022.3-2008. Полученные результаты позволили начать регистрацию “Лайн-Блот ВГЧ-профиль” в качестве медицинского изделия для скрининга антител в отношении основных возбудителей герпесвирусных инфекций, установления активности проявления инфекционного процесса и сроков инфицирования некоторыми из них.

Ключевые слова: герпесвирусные инфекции, линейный иммуноблоттинг, ИФА, клиническая информативность.

Международный комитет таксономии вирусов (ICTV) в обновленной классификации в семействе Herpesviridae выделяет более 120 видов ДНК содержащих вирусов и подразделяет их на 3 подсемейства: α-, β- и γ-герпесвирусов [1]. Восемь герпесвирусов являются патогенными для человека, они существенно различаются между собою по структуре генома, характеру репродукции, тропности к поражаемым клеткам, а также молекулярно-биологическим и иммунологическим особенностям [2]. К числу патогенных для человека α-герпесвирусов относят: вирусы простого герпеса 1 и 2 типа (HSV-1 и HSV-2) и вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса (VZV или HHV-3); из β-подсемейства: цитомегаловирус (CMV или HHV-5), вирус герпеса 6-го типа (HHV-6), являющийся возбудителем внезапной экзантемы и ассоциирующийся с синдромом хронической усталости и вирус герпеса 7-го типа (HHV-7), выявляемый у больных с синдромом хронической усталости; из подсемейства γ: вирус Эпштейна-Барра (EBV или HHV-4) и вирус герпеса 8-го типа (HHV-8), приводящий к развитию саркомы Капоши.

Имеются сообщения о возможности развития у человека энцефаломиелита со смертельным исходом, обусловленного заражением вирусом герпеса обезьян В [1-3].

По данным ВОЗ, герпесвирусные заболевания как причина смерти от вирусных инфекций занимают 2 место после гриппа, и этот показатель составляет 15,8% [4]. Эпидемиологическими исследованиями установлено, что к 18 годам более 90% городских жителей инфицированы одним или несколькими герпесвирусами, при этом в 50% случаев у инфицированных наблюдаются клинические рецидивы, в связи с отсутствием защитного иммунитета [5, 6, 7].

Интерес к изучению герпесвирусов обусловлен тем, что они активно проявляют себя при развитии иммунодефицитных состояний, приводя к развитию органных поражений и нейроинфекциям с высоким уровнем инвалидизации (50%) и летальных исходов (20%) [8, 9]; доказана высокая онкогенная активность HSV, CMV, EBV, HHV-8 и возможно HHV-6 [10]; а при инфицировании беременных HSV-1,-2, CMV способны приводить к развитию внутриутробному поражению и гибели плодов [8, 9, 11].

Герпесвирусы поражают практически все ткани и системы органов хозяина, где они непрерывно или циклично размножаются, обеспечивая постоянную готовность к клиническому обострению (персистенция). Как правило, герпесвирусы пожизненно сохраняться в морфологически и иммунохимически изменённой форме в нервных клетках регионарных спинальных ганглиев чувствительных нервов (латенция). Разные виды герпесвирусов имеют свои особенности персистенции и латенции (наиболее активными являются HSV-1 и HSV-2, наименее – EBV) [12, 13].

Иммунная система макрорганизма в ответ на инфицирование герпесвирусами отвечает выработкой защитных антител разных классов, но не обеспечивает полной элиминации вирусов из организма. Синтез вируснейтрализующих антител поддерживается в течение всей последующей жизни человека, иногда в высоких концентрациях, что сдерживает клиническое проявление инфекции, но и не предупреждает клинических рецидивов при ослаблении адаптивных и защитных механизмов [14-17].

Клинические проявления герпесвирусных инфекций разнообразны по локализации и распространенности патологического процесса, что также зависит от состояния иммунной системы человека и антигенного субтипа вируса. Инфекции HSV, CMV и EBV рассматривают как СПИД-индикаторные в связи с частым сочетанием с этой патологией; более того, многие HHV могут активировать ВИЧ, находящийся в стадии провируса, и являются кофакторами прогрессирования ВИЧ-инфекции и перехода в СПИД [18].

В последние годы активно изучаются различные аспекты эпидемиологии, клиники и профилактики инфекций, обусловленных относительно малоизвестными герпесвирусами человека: HHV-6, HHV-7 и HHV-8 [19]. Исследуется роль HHV-6 в этиологии онкологических, хронических демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы, рассеянного склероза, синдрома хронической усталости, внезапных экзантем у детей [20].

Одной из задач клинической лабораторной диагностики на современном этапе является обеспечение достоверной этиологической диагностики герпесвирусных инфекций, особенно при неясных клинических симптомах заболевания, а также для дифференциальной диагностики с другими персистирующими инфекциями (хламидийной, иерсиниозной и другими) и в случаях развития микст инфекций.

Этиологическая диагностика герпесвирусных инфекций у человека включает вирусологические (“золотой стандарт”), молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция) и серологические методы (иммуноферментный анализ) исследования, каждый из которых имеет свои показания к применению [21, 22].

Выявление в крови пациента специфических антител не характеризует активность вирусной инфекции, так как специфический гуморальный ответ на герпесвирусы отражает лишь инфицированность организма патогеном, а не защищенность от него. При этом длительная персистенция герпесвирусов может приводить к иммуносупрессии, в результате чего специфические IgM и IgG лабораторными методами могут не выявляться или определяться в невысоких титрах. Это обстоятельство снижает информативность серологических исследований при хронических герпесвирусных инфекциях, так как не позволяет дифференцировать латентную и хроническую инфекции, прогнозировать течение заболевания, определять тактику терапии больных. Тем не менее, сопоставление гуморальных показателей в динамике (по титру антител, определяемому в парных сыворотках, полученных с интервалом 14-21 суток) важно для установления динамики и диагноза в сложных случаях [21, 22].

Целью настоящего исследования явилась разработка нового оригинального набора реагентов для дифференцированно определения специфических антител к основным возбудителям герпесвирусных инфекций человека (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV) в рамках одного лабораторного исследования.

В качестве основы для реализации поставленной цели использовали линейный иммуноблоттинг (ЛИБ), так как указанный метод лабораторного исследования позволяет раздельно выявить специфические антитела сразу к нескольким возбудителям и оценивать участие каждого антигена в развитии иммунного ответа. Этот современный метод исследования является высокоспецифичным и высокочувствительным, он основан на технологии иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуносорбент в ЛИБ представлен узкими нитроцеллюлозными мембранами, на которые нанесены наиболее специфические иммунореактивные антигены изучаемых возбудителей в виде отдельных поперечных полос [23-25].

На основании изучения литературы и опыта конструирования ИФА наборов для размещения на иммуносорбенте в составе нового ЛИБ набора реагентов были использованы очищенные нативные и рекомбинантные (rec) антигены основных возбудителей герпесвирусных инфекций: rec мозаичный антиген HSV-1, TRX-гибрид (содержащий иммунодоминантные последовательности белка gG-1), rec мозаичный антиген HSV-2, TRX-гибрид (последовательности белка gG-2), rec VZV, TRX-гибрид, (последовательности белка gE), нативный антиген VZV, rec антигены EBV (ранний – EA, капсидный – VCA и ядерный – EBNA), rec мозаичный антиген CMV (содержит последовательности белков рр150, рр52, рр28 и gB).

Для лабораторного доклинического испытания разработанного набора реагентов были получены сыворотки крови от 128 ВИЧ-инфицированных лиц (ГБУЗ МО “МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского”), 86 беременных (Центр охраны здоровья матери и ребенка имени В. И. Кулакова) и от 105 лиц, проходивших лечение или обследование (ФНИЦЭиМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН). В качестве наборов реагентов сравнения использовали тест-системы для определения в ИФА антител к антигенам каждого из возбудителей герпесвирусных инфекций, разрешенные к применению в России.

В результате проведенной работы в отделе перспективных разработок ЗАО “ЭКОлаб” был создан набор реагентов “Лайн-Блот ВГЧ-профиль” (комплект № 1 – IgG, комплект № 2 – IgM). Структура иммуносорбентов представлена на схеме (Рис. 1), различия в их составе для комплектов № 1 и № 2 обусловлены особенностями гуморального ответа у человека и выявления специфических IgG и IgM при лабораторных исследованиях.

Оптимизированная процедура лабораторного исследования сыворотки или плазмы крови человека осуществляется в следующей последовательности:

• при определении антител класса М исследуемые образцы предварительно обрабатывают РФ-сорбентом для удаления ревматоидного фактора и избытка IgG;

• готовят рабочее разведение исследуемых образцов, вносят в реакционные продольные лунки планшета (ванночки), туда же погружают по одному стрипу иммуносорбента (с нанесенными антигенами); планшет инкубируют на горизонтальном шейкере, что обеспечивает взаимодействие и образование на соответствующих участках иммуносорбента фиксированных иммунных комплексов;

• 4-кратное промывание обеспечивает удаление всех не вступивших в реакцию белков из реакционных лунок и со стрипов;

• в реакционные лунки вносят конъюгат, что приводит к образованию на стрипах более сложных иммунных комплексов, не диссоциирующих при последующем промывании, в то время как не вступившие в реакцию компоненты удаляются;

• исследование завершается добавлением субстрата, содержащего хромоген и окислитель, инкубацией стрипов и остановкой окислительно-восстановительного процесса. В местах локализации на стрипах антигенов герпесвирусов и на контрольных линиях в результате окисления хромогена происходит образование локально окрашенных формазанов; интенсивность окраски пропорциональна содержанию специфических антител в исследуемых образцах.

Время исследования составляет 3,5 часа. Разборная конструкция рамки планшета позволяет проводить дробные постановки (от 1 до 8 стрипов), что делает удобным использование набора в разных лабораториях с различным потоком исследований.

Окрашивание контрольных линий (“0,5+ или cut off”, “2+” и “КВО”) позволяет оценить правильность выполнения процедуры исследования и контролирует внесение образца в реакционную лунку. Сопоставление окраски контролей с линиями, где нанесены антигены возбудителей, позволяет определить содержание специфических антител соответствующего класса к антигенам HSV-1, HSV-2, VZV, EBV и CMV в условных единицах “плюсах”: от “0,5+” до “4+”. Окрашивание реакционной линии слабее “cut off” (“0,5+”) расценивают как отрицательный результат.

Антигены VZV представлены 2-мя и EBV – 3-мя антигенными линиями, что позволяет определить стадию заболевания. Выявление IgG к gЕ VZV является маркером активной репликации вируса и подтверждает острую стадию заболевания, недавно перенесенную или бессимптомную инфекцию с активным размножением вируса. Иммуноглобулины M и/или G к капсидному или ядерному rec антигенам EBV позволяет уточнить клиническую форму течения инфекции [4, 26].

Клинические испытания нового набора реагентов проведены с 319 образцами сыворотки крови, в качестве наборов сравнения использовали разрешенные к применению в России ИФА тест-системы. Результаты, полученные в отношении каждой из герпесвирусных инфекций представлены на Рис. 2 и 3.

Установлено совпадение показателей для положительных, неопределенных и отрицательных результатов при определении специфических IgG в 80-95%, а для IgM в 79-91% случаев. Несовпадающие результаты наблюдали при определении IgG к HSV-1 – в 51, к HSV-2 – в 59, к VZV – в 12, к gE ВВЗ – в 28, EBNA EBV – в 72, EA EBV – в 59, VCA EBV – в 69 и к CMV – в 44 случаях и при определении IgM к HSV-1 в 41, к HSV-2 – в 28, к VZV – в 12, к VCA EBV – в 66 и к CMV – в 50 случаях.

336 образцов крови, с которыми получено расхождение результатов в ИФА и ЛИБ, были дополнительно исследованы в вестерн-блоте (WB) с наборами “Anti-HSV-1/HSV-2 EUROLINE-WB (IgG)”, “Anti-HSV-1/HSV-2 EUROLINE-WB (IgМ)”, “EUROLINE Anti-EBV-Profile 2 (IgG), “EUROLINE Anti-EBV-Profile 2 (IgM), “Anti-CMV (IgG) WESTERNBLOT”, и “Anti-CMV (IgM) WESTERNBLOT)” и наборами “Anti-ZVZ (IgG)” и “Anti-ZVZ (IgM)” (ELISA) производства фирмы “Euroimmun AG”, Германия. Полученные данные проанализированы и приведены на Рис. 4 и 5. Установлено совпадение результатов от 80 до 90%.

По совокупности совпадающих результатов исследования клинических образцов в ИФА и ЛИБ с 2 наборами реагентов разных производителей проведена завершающая аттестация клинических образцов по содержанию в них специфических IgG и IgM, а также осуществлены расчет и сравнительная оценка показателей клинической информативности (клинической чувствительности, специфичности и диагностической эффективности) разработанного набора реагентов (Табл. 1).

Как следует из данных таблицы, разработанный набор реагентов “Лайн-Блот ВГЧ-профиль” имеет достаточно высокие показатели диагностической информативности, которые соответствуют современным требованиям для лабораторных исследований и разрешенным к применению наборам реагентов сравнения отечественного и зарубежного производства.

1. На предприятии ЗАО “ЭКОлаб” (г. Электрогорск) разработан оригинальный набор реагентов “Лайн-Блот ВГЧ-профиль” (комплект

№ 1 – IgG и комплект № 2 – IgM), предназначенный для дифференцированного скрининга антител к антигенам герпесвирусных инфекций человека в формате линейного иммуноблоттинга. Новый набор реагентов позволяет в рамках одного исследования достоверно определять состояние гуморальных показателей иммунитета дифференцированно в отношении основных возбудителей герпесвирусных инфекций человека (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV), а также оценивать сроки инфицирования в отношении VZV и ЕВV.

2. Доклинические испытания, проведенные в лаборатории разработчика, показали высокую диагностическую информативность определения IgG (91,0-100%) и IgM (98,4-100%) с использованием набора реагентов “Лайн-Блот ВГЧ-профиль”, что позволяет представить его к регистрации в Российской Федерации в качестве медицинского изделия для применения в учреждениях здравоохранения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davison A., Eberle R., Ehlers B., Hayward G., McGeoch D., Minson A., Pellett Ph., Roizman B., Studdert M., Thiry E. The order Herpesvirales, // Arch of Virol 2009(Jan); 154(1): 171-177.

2. Исаков В. А., Архипова Е. И., Исаков Д. В. Герпеcвирусные инфекции человека: Руководство для врачей. // СПб.: СпецЛит, 2006.

3. Richard J. Herpesviruses: Chapter 68. // in Medical Microbiology, 4th ed.; Whitley: University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996.

4. Мурзич А. В., Голубев М. А. Герпетическая инфекция. // Южно-Российский медицинский журнал, 1998; 3 [https://medi.ru/info/6380/].

5. Gottlieb S. L., Douglas J. M. Jr., Schmid D. S. et al. Project RESPECT Study Group. Seroprevalence and correlates of herpes simplex virus type 2 infection in five sexually trans-mitted-disease clinics. // J Infect Dis 2002; 186: 1381-1389.

6. Chayavichitsilp P., Buckwalter J.V., Krakowski A.C., Friedlander S.F. Herpes sim-plex. // Pediatr Rev 2009(Apr); 30(4): 119-129 [PMID 19339385].

7. Staras S. A., Dollard S. C., Radford K. W., Flanders W. D., Pass R. F., Cannon M. J. Seroprevalence of cytomegalovirus infection in the United States, 1988–1994. // Clin Infect Dis 2006(Nov); 43(9): 1143–51 [PMID 17029132. Retrieved 2009-12-04].

8. Кускова Т. К., Белова Е. Г. Семейство герпес-вирусов на современном этапе. // Лечащий врач, 2004; 5 [http://www.lvrach.ru/2004/05/4531295].

9. Шульженко А. Е., Викулов Г. Х. Герпетические инфекции у человека – настоящее и будущее. // М.: ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ, 2003 [http://www.src.herpes.ru/her/hcp/dis/gh/Herpes2003.doc].

10. Новикова Е. В., Яковлева Л. С., Стени-

на В. Н., Гурцевич В. Э. Обнаружение и клинико-морфологическая характеристика опухолей желудка, ассоциированных с вирусом Эпштейна-Барр. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы 1999; 3(1): 103.

11. Логутова Л. С., Новикова С. В., Бочарова И. И.

Оптимизация ведения беременных с высоким инфекционным риском. // РМЖ, вып. от 28.01.2015; 1: 6.

12. Adams M. J., Carstens E. B. Ratification vote on taxonomic proposals to the Interna-tional Committee on Taxonomy of Viruses (2012). // Arch Virol 2012(Jul); 157(7): 1411–22 [PMID 22481600].

13. Whitley R. J. Herpesviruses. // in: Baron’s Medical Microbiology, 4th ed. Univ of Texas Medical Branch, 1996 [ISBN 0-9631172-1-1].

14. Баринский И. Ф. Герпесвирусные инфекции – иммунодефицитные заболевания ХХI века. // Актуальные проблемы герпесвирусных инфекций. М., 2004: 5-7.

15. Самгин М. А., Халдин А. А. Простой герпес (дерматологические аспекты). // М.: МЕДпресс-информ, 2002.

16. Исаков В. А., Ермоленко Д. К., Ермоленко Е. И. Герпесвирусные и папиллома-вирусные инфекции. / В кн: Аковбян В. А., Прохоренков В. И.,

Соколовский Е. В. [ред.] “Инфекции, передаваемые половым путем”. // М.: Медиа Сфера, 2007. С. 448-513.

17. Серебряная Н. Б. Новые подходы к терапии герпесвирусной инфекции. // СПб: Новая альтернативная полиграфия, 2007.

18. Рахманова А. Г., Пригожкина В. К., Неверов В. А. Инфекционные болезни: Руководство для врачей общей практики. // М.-СПб., 1995.

19. Ward K. M., Andrews N. J., Verity C. M., Miller E. Human herpesviruses-6 and -7 each cause significant neurological morbidity in Britain and Ireland // Arch Dis Child, 2005; 90(6): 619-623.

20. Калугина М. Ю., Каражас Н. В., Рыбалкина Т. Н., Бошьян Р. Е., Ермакова Т. М., Тебеньков А. В. Актуальность диагностики инфекции, вызванной вирусом герпеса человека 6-го // Детские инфекции, 2012; 1: 60-63.

21. Львов Д. К. [ред.] Медицинская вирусология. // М., Медицинское информационное агентство, 2008.

22. Лабораторная диагностика инфекционных вирусных заболеваний, 2-е изд. // СПб., 2004.

23. Марданлы С. Г. Иммуноферментные тест-системы ЗАО “ЭКОлаб” для диагностики простого герпеса. // Клин. лаборат. диагностика, 2008; 2: 35-38.

24. Марданлы С. Г., Асратян А. А., Иммуноферментные тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции. // ЖМЭИ 2008; 3; 98-100.

25. Марданлы С. Г., Арсеньева В. А., Акиншина Ю. А., Амелина Е. А., Захаров М. В., Никитина А. В. Разработка нового набора реагентов для скрининговой диагностики с целью одновременного обнаружения антител к каждому из основных возбудителей инфекций TORCH-группы методом линейного иммуноблоттинга. // Эпидемиология и инфекционные болезни: Актуальные вопросы 2014; 6: 24-29.

26. Balfour H.H, Dunmire S. K Jr, Hogquist

K. A. Infectious mononucleosis. // Clin Transl Immunol, 2015(Feb); 4(2): e33 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 4346501/].