СКАЧАТЬ ПУБЛИКАЦИЮ (12.1 Кб в архиве, doc) |
СКАЧАТЬ ИЗДАНИЕ ЦЕЛИКОМ (11.7 Мб, pdf) |
Современное состояние и направления развития производства питательных сред в России
Шепелин А. П.
ФБУН Государственный научный цент прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск
В лабораторной медицине успешно внедряются национальные стандарты, регламентирующие требования к организации деятельности лабораторий и свойствам средств лабораторного анализа. Большая работа в этом направлении проводится научно-практическим обществом специалистов лабораторной медицины. Научные публикации, семинары, конференции и методические рекомендации по применению положений и требований национальных стандартов в практику клинико-диагностических лабораторий способствуют их успешному внедрению. Стандартизация лабораторных методов исследований обеспечивает наиболее успешное функционирование лабораторий, удовлетворение сотрудников условиями и результатами своего труда, адекватное взаимопонимание с клиническим персоналом и пациентами [1, 2].
Для диагностики инфекционных заболеваний важную роль занимают бактериологические методы исследований, включая выделение возбудителя с использованием дифференциально-диагностических питательных сред. Для качества результатов исследований необходимо применение стандартных питательных сред, реагентов и использование в работе стандартных методик в ходе взятия клинического материала, проведения и учета результатов исследования.
Питательные среды являются одним из важнейших компонентов лабораторных микробиологических исследований. Количество питательных сред (с учетом модификаций), по различным источникам, превышает 5 тыс. прописей. В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые производятся в промышленных масштабах. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав [3, 4].
Существенный вклад в нормативно-правовое регулирование производства и применения изделий медицинского назначения внес Федеральный закон от 01.11.2011 № 323 “Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации”.
В п. 1 ст. 38 указанного закона дано определение медицинских изделий: “Медицинскими изделиями являются любые инструменты, аппараты, приборы, оборудование, материалы и прочие изделия, применяемые в медицинских целях... предназначенные производителем для профилактики, диагностики, мониторинга состояния организма человека, проведения медицинских исследований…”. В соответствии с этим определением питательные среды, используемые для диагностики инфекционных заболеваний, относятся к медицинским изделиям [5].
Важной составляющей санитарно-эпидемиологического надзора за инфекционными болезнями является система методов и средств их лабораторной диагностики. Быстрая и точная индикация и идентификация инфекционного патогена – определяющий фактор для своевременного проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий с целью предупреждения распространения инфекции и назначения адекватного лечения, предупреждения экономического ущерба от временной потери трудоспособности заболевшими гражданами.
Среди методов микробиологической диагностики культуральный метод занимает особое место, являясь “золотым стандартом” лабораторной диагностики, поскольку именно обнаружение возбудителя заболевания при культивировании на питательных средах является убедительным доказательством инфекционной природы болезни [6-9].
Перечень питательных сред, необходимых в работе микробиологической лаборатории, определяется, в первую очередь, её спецификой, оснащением и финансовыми возможностями.
Основные отечественные производители питательных сред (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, НПО “Питательные среды” Махачкала, НИЦФ и др.) обеспечивают до 50% рынка в РФ. Остальное – импортные среды, среди которых большую часть составляют питательные среды для микроорганизмов со сложными питательными потребностями, готовые к применению в чашках Петри, транспортные среды, хромогенные, дифференциально-диагностические среды в картриджах для бактериологических анализаторов и др.
В связи с введением экономических санкций в отношении РФ со стороны США, стран ЕС, Японии и ряда других стран закупка продукции для бактериологических анализаторов, высокотехнологичных питательных сред будет ограничена.
Актуальной становится разработка состава и технологии производства импортзамещающих питательных сред.
ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора является одним из основных производителей питательных сред в России. Проведение научных исследований в области разработки питательных сред для широкого круга микроорганизмов, включая возбудителей особо опасных инфекций, туберкулёза, кишечных инфекций, гнойных бактериальных менингитов и др., началось в 80-е годы ХХ столетия. В настоящее время номенклатура выпускаемых препаратов в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора составляет около 100 наименований. Большинство питательных сред прошли все этапы Государственных испытаний, зарегистрированы в качестве медицинских изделий Росздравнадзором и разрешены для применения в практическом здравоохранении. Питательные среды производства ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора широко используются бактериологическими лабораториями страны для выделения и дифференциации энтеробактерий, для диагностики особо опасных инфекций, дисбиотических состояний, дифтерии, гнойных бактериальных менингитов, при контроле микробной загрязнённости нестерильных лекарственных средств и др.
Сотрудники ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора имеют большой опыт работы по созданию прописей бактериологических питательных сред, разработке технологии производства питательных сред, организации производства, сертификации продукции. В ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора функционируют отдел биологического и технологического контроля, отдел обеспечения качества.
На завершающем этапе разработки находятся следующие отечественные питательные среды.
1) Агар Мюллера-Хинтон для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам;
2) Агар Байард-Паркера – селективный агар для выделения и количественного учёта Staphylococcus aureus в пищевых продуктах и фармацевтическом материале;
3) Агар Фогеля-Джонсона для выявления коагулазо- и маннитположительных S. aureus;
4) Триптон-соевый агар для культивирования широкого круга микроорганизмов;
5) Цетримидный агар для выделения и дифференциации Pseudomonasаeruginosa из различного материала;
6) Триптон-желчный агар для обнаружения и подсчёта бактерий E.coli и других колиформных бактерий в воде с помощью метода мембранной фильтрации;
7) Агар Мосселя для выделения Bacillus сereus;
8) Бульон Мосселя для накопления энтеробактерий;
9) Бруцелла бульон для культивирования возбудителя бруцеллёза.
В настоящее время остро стоит вопрос об организации производства в России питательных сред для культивирования высокотребовательных микроорганизмов, обладающих сложными пищевыми потребностями таких, как:
1) Агар с сердечно-мозговой вытяжкой (Brain-heartinfusion agar);
2) Бульон с сердечно-мозговой вытяжкой (Brain-heartinfusionbroth);
3) Основа колумбийского агара для высоко требовательных микроорганизмов;
4) Двухфазная питательная среда для гемокультур;
5) Основа кровяного агара;
6) Желчно-эскулиновый агар для энтерококков;
7) Среды для стрептококков;
8) Бульон MRS;
9) Шедлер агар для анаэробов.
Несмотря на широкое внедрение в бактериологическую практику методов генодиагностики и геноиндикации, бактериологический метод остаётся “золотым стандартом” в диагностике большинства инфекций. Этот метод включает посев исследуемого материала на плотные питательные среды с последующим выделением и идентификацией чистой культуры возбудителя. Основной недостаток бактериологического метода – длительность исследования. Для быстрорастущих микроорганизмов результат может быть получен не ранее, чем через 2-3 суток после посева на питательную среду. Для ускоренной идентификации выделяемых культур в состав питательных сред для первичного посева или накопления чистой культуры обычно вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В классическом варианте это углеводы (лактоза, сорбит, сахароза и т. д.), многоатомные спирты, аминокислоты, мочевина или другие субстраты, при расщеплении которых ферментами микроорганизмов образуются вещества, изменяющие рН или окислительно-восстановительный потенциал питательной среды.
В результате появления продуктов ферментации индикатор изменяет свой цвет и окрашивает, например, колонии микроорганизмов и питательную среду вокруг, помогая отличить их от бесцветных (неокрашенных) колоний микроорганизмов, не ферментирующих данный субстрат. Дифференциация при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителей разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных питательных сред. Для более чёткой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты.
В конце ХХ века в бактериологическую практику вошли дифференциальные среды нового поколения – хромогенные, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. К таким ферментам относятся, например, β-D-глюкуронидаза Escherichia coli или β-D-глюкозидаза энтерококков. Для обнаружения уникального фермента и, соответственно, идентификации микроорганизма, в состав питательной среды вводят хромогенный субстрат – вещество, при расщеплении которого данным ферментом образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате рост микроорганизмов окрашивается в определённый цвет или приобретает способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав питательных сред (в том числе селективных) для первичного посева, то результат – выделение чистой культуры и её идентификация – может быть получен уже в течение первых суток исследования. Иногда при этом требуется проведение быстрых подтверждающих тестов (например, капельный тест на индол с реактивом Ковача для E. coli).
Хромогенные среды предназначены для быстрой (в течение 24 ч) индикации в исследуемом материала целого ряда микроорганизмов, имеющих важное значение для клинической и санитарной микробиологии: E. coli и другие колиформные бактерии, сальмонеллы и энтерогеморрагические эшерихии (E. coli О157:Н7), энтерококки, Staphylococcus aureus, клостридии, Pseudomonasaeruginosa, Candida albicans, другие проблемные грибы и бактерии.
Наиболее востребованы следующие хромогенные питательные среды:
1) Хромогенный агар для E. coli O157;
2) Основа хромогенного агара Мак Конки с сорбитом;
3) Хромогенный агар для энтерококков;
4) Основа хромогенного агара для листерий;
5) Хромогенный бульон для колиформных бактерий и Е. coli;
6) Хромогенный агар для выделения метициллинустойчивых S. aureus (MRSA агар);
7) Хромогенный агар для грибов рода Candida;
8) Хромогенный агар для определения энтеробактерий, продуцирующих β-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС);
9) Хромогенный агар для выделения, подсчёта микроорганизмов в моче и прямой идентификации E. coli, Enterococcus, группы KESC (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter) и Proteus в один этап.
Эффективность микробиологической диагностики инфекционных заболеваний зависит не только от выбранного метода исследования и его характеристик, но и от качества проведения преаналитического этапа исследования, включающего взятие и транспортировку клинического материала в лабораторию для анализа. Даже незначительные ошибки на этом этапе исследований неизбежно ведут к искажению окончательных результатов, не позволяя получить достоверные данные. По сведениям многих авторов на преаналитический этап приходится от 57 до 68% всех диагностических ошибок, которые ведут к необходимости проведения повторных исследований, но, что ещё более серьёзно, – к неправильной постановке диагноза. Для повышения качества лабораторных исследований, в первую очередь необходимо повысить качество сбора проб биологического материала и транспортирования его в лабораторию.
Одним из возможных путей предотвращения ошибок преаналитического этапа является использование надлежащих транспортных систем, содержащих транспортные питательные среды. Использование для транспортировки аналита (гной, кишечное содержимое и т.п.) обычных питательных сред является, зачастую, серьёзной ошибкой, поскольку в них идёт быстрое размножение менее требовательных сапрофитных микроорганизмов.
Промышленный выпуск транспортных сред осуществлён в Европе ещё в 1975 году. В России промышленное производство транспортных сред до сих пор отсутствует, несмотря на то, что научные разработки и промышленный выпуск сухих питательных сред начаты ещё в 1952 г. в Дагестанском научно-исследовательском институте по производству питательных сред, а с 80-х годов проводились и в ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии.
К числу основных транспортных сред относятся: среда Кэри Блэйер, среда Эймса, среда Эймса с углём, среда Стюарта и специальные транспортные среды для отдельных видов микроорганизмов. Перечисленные среды не являются питательными, содержат фосфатный буферный раствор и тиогликолят натрия, предназначены для сбора и транспортировки только бактериологических проб. Транспортная среда, с одной стороны, обеспечивает сохранение жизнеспособности микроорганизмов, и, в то же время, обязана ограничивать их размножение.
Среда Стюарта предназначена для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде около суток, прочие – до нескольких дней. Транспортная среда Кэри Блэйер представляет собой модификацию транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных и ректальных образцов. Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.
Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменён неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiellapneumoniae, ets.) и может поддерживать рост некоторых грам-
отрицательных микроорганизмов. Метиленовый синий заменён на активированный уголь. В транспортную среду добавлены соли кальция, магния для поддержания проницаемости бактериальных клеток. Эта транспортная среда способна более 3 дней поддерживать жизнеспособнымитакие микроорганизмы, как Neisseriaspp., Haemophilusspp., Corynebacteriumspp., Streptococcusspp., Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты даёт культивирование в течение первых 24 часов.
Необходимы специальные транспортные среды для отдельных видов микроорганизмов, таких как вибрионы, кампилобактерии и др., для сохранения и транспортировки которых не подходит ни одна из перечисленных сред.
Заключение
В связи с введением экономических санкций в отношении России со стороны США, стран ЕС, Японии, ряда других стран импортозамещение становится одной из стратегических задач российской экономики. Разработка состава и технологии производства отечественных импортзамещающих питательных сред призвана удовлетворить потребности лабораторной службы России в расходных материалах, обеспечить адекватный ответ на возникающие вызовы и новые биологические угрозы и поддержание биобезопасности государства на должном уровне.Представленные данные по обоснованию номенклатуры питательных сред и транспортных систем позволит в полном объёме удовлетворить потребности клинической и санитарной микробиологии в питательных средах отечественного производства и отказаться от импортных поставок, не снижая при этом качества микробиологических исследований.
Литература:
1. Меньшиков В.В. Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты // М., 2005 – 251 с.
2. Меньшиков В.В. Критерии оценки методик и результатов клинических лабораторных исследований. Справочное пособие // М., Лабора, 2011 – 327 с.
3. Шепелин А.П., Дятлов И.А. Роль и место микробиологии в решении вопросов модернизации здравоохранения. Аналитический обзор. Протвино: А-Принт ЗАО, 2012 – 112 с.
4. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. Белковыегидролизаты в производстве питательных сред. Обзорная информация. М., ВНИИ СЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990, вып. 9-10 – С. 52.
5. Крылова Т.Г., Комарова Т.Я. Новые аспекты государственной регистрации медицинских изделий // Вестник Росздравнадзора. 2012, № 5, С. 4-9.
6. Домотенко Л.В. Бифидум-среда для выделения и культивирования бифидобактерий./ Домотенко Л.В., Шепелин А.П. // Инфекции и иммунитет, 2014 – т. 4, № 3 – С. 279-283.
7. Домотенко Л.В., Сравнительные испытания лактобак агара и MRS / Домотенко Л.В., Шепелин А.П., Детушев К.В. // Курский научно-практический вестник “Человек и его здоровье”, 2014, № 4 – С. 5-10.
8. Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г., Клюкина Т. В.
Основы клинической микробиологии и иммунологии. Учебное пособие / под ред. проф.
А.Ю. Миронова. – Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ, 2011 – 248 с.
9. Харсеева Г.Г., Дифтерия: микробиологические и иммунологические аспекты / Алутина Э.Л., Гасретова Т.Д., Дятлов И.А., Лабушкина А.В., Миронов А.Ю., Ненадская С.А., Симованьян Э.М., Сылка О.И., Тюкавкина С.Ю., Харсеева Г.Г., Шепелин А.П. // М.: Практическая медицина, 2014 – 241 с.
ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора
Федеральное бюджетное учреждение науки “Государственный научный центр
прикладной микробиологии и биотехнологии” Роспотребнадзора
142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск
Тел.: +7 (4967) 36-00-03, +7 (4967) 36-00-10
www.obolensk.org • e-mail: info@obolensk.org